辽宁省自然科学基金(20082095)
- 作品数：5 被引量：8H指数：2
- 相关作者：秦晓松刘勇刘建华吴丽娜佟威威更多>>
- 相关机构：中国医科大学德岛大学更多>>
- 发文基金：辽宁省自然科学基金辽宁省高校科研计划项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 人Nephrin—GFP融合蛋白真核表达载体的构建和鉴定被引量：2
- 2010年
- 目的构建人19号染色体长臂Nephrin基因和绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）真核表达质粒，为进一步研究肾小球裂隙隔膜分子复合物构成与功能提供基础。方法设计引物，扩增真核表达质粒pEGFPN3中的GFP基因片段，将其插入nephrin原核表达载体pcDNA3．1 nephrin V5-His，重组质粒经酶切鉴定后测序，并转染至COS-7细胞观察表达情况及生物学特性。结果成功构建pcDNA3．Inephrin—GFP重组质粒，并将Nephtin—GFP融合蛋白成功表达于COS-7细胞，进一步经交联实验证明Nephtin—GFP融合蛋白具有正确的细胞膜表达。结论利用pEGFPN3和pcDNA3．1nephtinV5-His可成功重组Nephrin—GFP表达质粒，为进一步研究肾小球裂隙隔膜分子复合物构成及其功能提供有利工具。
- 秦晓松刘勇塜口裕康
- 关键词：重组质粒
- Nephrin分子细胞内吞转运途径的研究被引量：2
- 2010年
- 为研究nephrin分子在细胞内的转运途径,探讨其在维持肾小球裂孔膜完整性上的作用,构建了nephrin真核表达载体,并转染至COS-7细胞内,应用免疫荧光三重标记的方法,分别进行细胞内及细胞表面的荧光标记,联合笼型蛋白介导的内吞(clathrin-mediated endocytosis,CME)和脂筏介导的内吞(raft-mediated endocytosis,RME)标记物,通过共聚焦显微镜对裂隙膜分子nephrin在不同时间点细胞内的内吞转运特点进行研究。结果发现在转运启动2 min时,68.44%±4.65%的nephrin通过CME途径进行细胞内转运;在20 min时,65.24%±4.02%的nephrin以RME途径进行转运,并且两种转运途径均可被相关途径抑制物所阻断。表明nephrin通过两种途径进行细胞内转运,提示不同的转运途径可能与其实现不同功能有关。
- 秦晓松刘勇吴丽娜刘建华王丹丹
- 关键词：NEPHRIN免疫荧光技术蛋白质转运
- 抗体交联作用促进Nephrin簇集于细胞膜脂筏微区被引量：1
- 2010年
- 为研究nephrin在细胞膜上的表达特点,构建nephrin和podocin的表达质粒,转染COS-7细胞。采用胞吞摄取和抗体交联实验,发现nephrin的内吞囊泡与GM1神经节苷脂的十价配体CTxB及podocin囊泡共存;特异性抗体交联促进nephrin与脂筏(lipid raft)标记物CTxB共同聚集于脂筏微区;蔗糖密度梯度离心显示无论是表达nephrin的COS-7细胞还是大鼠肾小球细胞中部分nephrin与脂筏标志物小窝蛋白(caveolin)等均存在于去污剂抵抗膜成分中。结果提示nephrin为脂筏相关蛋白,并且特异抗体交联促进nephrin聚集于脂筏微区。
- 秦晓松刘勇佟威威岳丹刘建华刘岩
- 关键词：NEPHRIN脂筏
- Nephrin和Podocin的细胞内共定位及相互作用被引量：4
- 2010年
- 目的研究肾小球裂孔隔膜分子Nephrin和Podocin的细胞内表达及相互作用。方法构建载有Nephrin和Podocin羧基端的质粒载体,双重转染的COS-7细胞,采用双免疫荧光标记后经共聚焦显微镜观察Nephrin和Podocin的细胞内分布情况;构建载有谷胱甘肽S-转移酶（GST）-Nephrin,-Podocin的质粒载体转化至感受态细菌后提取融合蛋白,应用免疫共沉淀及GST pull-down分析研究体外培养的COS-7细胞内和大鼠肾小球细胞内Nephrin和Podocin蛋白间的相互作用。结果 Nephrin和Podocin在体外培养的COS-7细胞内共存,二者共存于细胞质的囊泡样结构内,尤其在细胞膜上重合为线样结构;体内和体外实验结果均表明二者存在相互作用,具体的作用部位为细胞内段的羧基端,Nephrin 1 134~1 241氨基酸区域与Podocin 262~383氨基酸区域存在相互作用。结论裂孔隔膜分子Nephrin和Podocin具有体内、体外的物理作用,可能与维持裂孔隔膜的功能和结构稳定性有关。
- 秦晓松谭明旗塚口裕康
- 关键词：NEPHRINPODOCIN免疫共沉淀
- 在笼型蛋白和脂筏介导的两种内吞途径中nephrin的磷酸化修饰动力学不同
- 2010年
- 研究肾小球裂隙膜的主要成分nephrin分子在细胞内的转运途径及不同转运途径对nephrin磷酸化的影响.分别应用笼型蛋白介导的内吞(clathrin-mediated endocytosis,CME)和脂筏介导的内吞(raft-mediated endocytosis,RME)标记物转铁蛋白和霍乱毒素B亚基对nephrin的内吞过程进行分析,并进一步应用两种内吞途径阻断物EPS15Δ和Dyn2aK44A,研究阻断nephrin的内吞途径对其磷酸化水平的影响.结果显示,nephrin通过笼型蛋白和脂筏介导的两种内吞途径以不同速率进行内吞;与Src酪氨酸激酶家族成员Fyn共表达时,细胞内nephrin酪氨酸磷酸化被增强,而在Src家族激酶抑制剂PP2的作用下,nephrin酪氨酸磷酸化被减弱,表明nephrin的磷酸化过程是Fyn依赖的;内吞20min时,笼型蛋白介导的内吞途径的特异性阻断物EPS15Δ降低了nephrin磷酸化水平、笼型蛋白和脂筏介导的内吞途径的通用抑制剂Dyn2aK44A则增加了nephrin的磷酸化水平,综上结果表明:单独阻断脂筏介导的内吞可引起nephrin的磷酸化水平增加,脂筏介导的内吞对nephrin磷酸化过程起下调作用.
- 秦晓松郑锐潘莉莉吴丽娜佟威威刘岩岳丹
- 关键词：NEPHRIN内吞蛋白质转运
