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利用根癌农杆菌T-DNA插入突变寻找参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因被引量：4: 2012年; 【目的】新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是人类重要致病真菌,主要毒性因子之一漆酶的表达受葡糖糖阻遏,机制未知。本文拟寻找参与葡萄糖阻遏的关键基因。【方法】建立根癌农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumefanciens-mediated transformation,ATMT)建立一个容量约200000的随即插入突变文库,在高浓度葡萄糖条件下从中筛选葡萄糖去阻遏的突变株。通过Southern确定突变株中T-DNA的拷贝数,利用反向PCR获得依赖葡萄糖的漆酶阻遏基因序列。【结果】筛选到了30株葡萄糖去阻遏突变株,Southern blot发现83%的葡萄糖去抑制突变株含有单个T-DNA拷贝。初步鉴定了可能参与漆酶阻遏的10个不同生物学功能基因,如参与碳水化合物的代谢,固醇的合成,几丁质的合成,GPI脂锚钩的合成等等。【结论】ATMT突变策略可以找到一些参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因,为理解漆酶在致病过程中的作用机制和工业改进漆酶活性提供参考。; 李中明潘皎朱旭东; 关键词：新型隐球酵母漆酶

生长条件影响新型隐球酵母漆酶表达的比较分析: 2009年; 对病原真菌新型隐球酵母致病因子漆酶的表达进行了分析,实验发现不同血清型菌株漆酶表达调控有所不同,高毒性血清型A型菌株H99在稳定期初期漆酶活性高于血清型D型菌株,但漆酶活性最终值远低于D型菌株JEC21。铜离子的对二者漆酶的诱导作用也不一致,血清型A型菌株H99,漆酶的表达量随培养基中的铜离子浓度的增加而增加;而对于血清型D型菌株JEC21,则是在低浓度铜离子(10μmol/L)诱导时漆酶活性达最大值,而当培养基中铜离子的浓度继续增大,漆酶的活性逐渐降低,与葡萄糖不同,培养基中氮源对漆酶的表达有一定抑制作用,但不同氮源对漆酶的表达抑制作用不同。培养温度升高使漆酶活性降低,铜离子可以在有高糖、高温等抑制条件下诱导漆酶表达,这些观察均未见报道,对研究漆酶的生产应用和揭示其生物学功能有一定参考价值。; 祝嫦巍潘皎严冰朱旭东; 关键词：漆酶新型隐球酵母

新型隐球酵母氯离子通道在阳离子内稳态中的趋异作用: 2012年; 新型隐球酵母Cryptococcus neoformans有两个变种(varieties),即grubii和neoformans。目前研究最多的两个菌株H99(血清型A)和JEC21(血清型D)分别代表这两个变种,两者的毒性差别显著,为研究新型隐球酵母菌株间毒性的进化提供了良好模型。通过比较JEC21的clc1-突变体Tx1与早先鉴定的H99clc1-菌株Mlac3发现,JEC21CLC1同样决定铜离子的吸收。Tx1中丧失的漆酶活力可以通过外源Cu2+的加入得以恢复,而漆酶基因LAC1的转录与野生型相比没有明显变化,此外铜离子转运蛋白基因CTR4在Tx1中的转录水平有着明显的上调,并且不能被外源铜离子抑制--这说明Tx1细胞中缺乏铜离子。另外实验发现,Tx1对1mol/L Na+或者K+十分敏感,生长受到明显的抑制,而Mlac3则不受影响。同时,与Mlac3不同,Tx1在pH8.0的条件下仍然能够正常生长。实验表明,CLC1在新型隐球酵母不同变种中对于Cu2+存在相同调节作用,但是对于Na+、K+、H+的调节作用在JEC21与H99菌株间存在差异。这个工作对于解释H99和JEC21间的毒力差异提供了证据。; 李东张笑娇杨娇潘皎朱旭东; 关键词：漆酶阳离子

人类致病菌新型隐球酵母Snf1/AMPK蛋白激酶调节细胞壁的完整性(英文)被引量：2: 2011年; 【目的】Snf1/AMPK在真核生物中是重要的且高度保守的一类蛋白激酶。在新型隐球酵母中,SNF1基因在调节致病因子的生物合成和细胞毒力方面具有重要作用。本文进一步报道了该基因在维持细胞壁完整方面的新功能,这一功能在其他微生物中未见报道。【方法】利用荧光增白剂染料(Calcofluor white dye)染色,荧光显微观察细胞分离、胞壁完整性;利用恒定流速和压力水流冲击菌落,测定细胞黏附琼脂表面能力;在含有十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS),刚果红(Congo red)染料和增白剂(FluorescentBrightener 28)的培养基上观察突变株的生长情况,以验证细胞壁完整性。【结果】SNF1基因突变菌株对细胞壁抑制剂SDS等敏感,表明细胞壁完整性的损坏;在葡萄糖固体培养基上表现为细胞与琼脂间的黏附力丧失;在热击压力下,该菌株不能正常生长,而这种生长缺陷能够被渗透平衡抑制。【结论】新型隐球酵母SNF1基因对于维持细胞壁完整性是非常重要的,并且影响细胞与琼脂间黏附作用以及细胞对抗热的能力。; 杨娇李东潘皎朱旭东

条件致病真菌新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)致病性研究进展被引量：4: 2009年; 真菌感染引起的疾病在临床上呈现较快的上升趋势,在国际上引起了广泛的重视。新型隐球酵母是主要病原真菌之一。过去十余年,对其致病的分子生物学研究有了较大的进展。重要致病因子(virulence factors)的合成调控及致病过程中信号传导途径等研究进展较快,这些都可能成为治疗甚至预防该真菌的焦点。本文在简要介绍致病因子的基础上,详细综述了分子生物学研究的进展情况。; 姜楠张德法严冰潘皎朱旭东; 关键词：新型隐球酵母致病因子荚膜漆酶信号传导

新型隐球酵母铜应答转录因子Cuf1与荚膜的生物合成相关性(英文): 2009年; 【目的】新型隐球酵母是人类条件致病真菌,主要感染免疫缺陷患者。该酵母最显著的特征是细胞外包被着多糖荚膜,这一重要致病因子的调控机制复杂。本文研究旨在阐述编码铜依赖转录因子的CUF1基因对其荚膜生物合成的负调控作用。【方法】以野生型菌株为对照,对CUF1缺失的突变菌株进行菌落形态观察、荚膜墨汁染色的显微观察、细胞聚沉试验以及荚膜定量分析。【结果】与野生型菌株相比,Δcuf1突变株产生的菌落更粘,显微镜下亦可明显观察到荚膜更厚。同样数量的细胞,突变株聚沉平衡后体积更大。此外,荚膜粗提物定量称重分析也证明突变株产生了更多的荚膜。并且外源铁可以回复Δcuf1突变株荚膜过量产生的表型。【结论】铜应答转录因子1(Cuf1)对荚膜的生物合成具有负调控作用。Cuf1可能通过铁的高亲和吸收途径调控铁吸收而实现该作用的。; 姜楠刘晓光潘皎王雅洁朱旭东; 关键词：荚膜新型隐球酵母致病因子

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