国家自然科学基金(81171632)
- 作品数：8 被引量：20H指数：3
- 相关作者：景涛鲁俊辛奇高海军吕薇更多>>
- 相关机构：兰州大学西藏自治区疾病预防控制中心海南医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金中央高校基本科研业务费专项资金中央级公益性科研院所基本科研业务费专项更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 泡球蚴持续感染对小鼠肝脏纤维化的影响被引量：6
- 2021年
- 目的评价泡球蚴持续感染对小鼠肝脏纤维化的影响,为研究泡型棘球蚴病肝纤维化进展及其治疗方法提供参考。方法以泡球蚴感染长爪沙鼠血清(25、50、100μL)和泡球蚴及其生发层细胞、原头节分别对肝星状HSC-T6和LX-2细胞进行体外刺激48 h,采用CCK-8法检测细胞增殖,应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测HSC-T6细胞培养上清中Ⅰ型胶原蛋白(collagen 1,Col1)和α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达量。收集泡球蚴感染1、2、4、6、8个月小鼠血清和肝脏,分别采用ELISA法检测血清中Col1和α-SMA含量,采用天狼猩红染色法动态观察肝脏胶原纤维沉积情况。结果泡球蚴感染沙鼠血清体外可诱导HSC-T6和LX-2细胞增殖,不同血清剂量组细胞增殖率差异均有统计学意义(FHSC-T6=126.50、FLX-2=201.50,P均<0.05);其中100μL血清对HSC-T6和LX-2细胞促增殖率最高,HSC-T6和LX-2细胞增殖率分别为(573.36±206.34)%和(940.38±61.65)%。泡球蚴感染沙鼠血清体外刺激后,HSC-T6细胞培养上清中Col1和α-SMA蛋白含量均上升;且以100μL血清刺激后Col1和α-SMA含量最高,分别为(20.99±2.01)ng/m L和(305.52±16.67)pg/mL。泡球蚴及其生发层细胞、原头节均可体外诱导HSC-T6和LX-2细胞增殖,增殖率分别为(142.65±9.17)%和(189.99±7.75)%、(118.55±8.96)%和(122.54±0.21)%、(156.34±17.45)%和(160.59±31.41)%,不同刺激组细胞增殖率差异均有统计学意义(FHSC-T6=11.24、FLX-2=47.72,P均<0.05);泡球蚴及其生发层细胞、原头节刺激后,HSC-T6细胞培养上清中Col1和α-SMA含量均增高;且以泡球蚴作用最为明显,Col1和α-SMA含量分别为(4.43±2.23)ng/mL和(285.20±90.67)pg/mL。泡球蚴感染后1~8个月,小鼠肝脏中胶原纤维沉积持续增加;小鼠血清中Col1水平在感染后6个月达最高,为(280.26±23.04)ng/mL;α-SMA水平在感染后8个月达最高,为(33.68±4.45)ng/mL。结论泡球蚴持续感染可促进肝�
- 高海军庞华胜孙旭冬张颋张颋景涛莫筱瑾莫筱瑾
- 关键词：泡球蚴肝星状细胞胶原纤维原头节
- 多频聚焦超声波对细粒棘球蚴囊壁药物通透性的影响
- 2016年
- 将人工接种感染的小鼠腹腔细粒棘球蚴包囊90个,随机分为A^E 5组,分别用多频聚焦超声不同功率和组合方式进行超声照射.多频聚焦超声辐照后的各组包囊置于含1 00μg/mL阿苯达唑的RPMI 1640培养液中,经不同时间培养后,高效液相色谱法测定细粒棘球蚴囊内的药物质量浓度,以评价不同功率及辐照次数、辐照后含药培养液中不同培养时间对囊壁药物通透性的影响.结果显示:多频聚焦超声照射可以改变细粒棘球蚴囊壁的药物通透性.三频联合与单频相比,以及两次以上照射与单次照射相比,细粒棘球蚴囊内药物质量浓度差异均具有统计学意义.照射后包囊继续在含药培养基中培养,可进一步提高囊内药物质量浓度.本研究证实多频聚焦超声照射可使细粒棘球蚴囊壁药物通透性持续增加.多频联合超声作用的效果明显优于单频、多次照射优于单次照射.多频多次照射、适当延长包囊在药物中的培养时间能够最大程度地提高囊内药物质量浓度.
- 孙萃萍叶华刘婧王炜高海军包根书韩俭景涛
- 关键词：高效液相色谱法通透性细粒棘球绦虫囊壁
- 细粒棘球绦虫果糖二磷酸醛缩酶的生物信息学分析及其表达与活性检测被引量：4
- 2014年
- 目的利用生物信息学方法分析细粒棘球绦虫果糖二磷酸醛缩酶(EgFBPA)的结构和功能特征,并利用基因工程技术进行克隆、表达、纯化,获得活性蛋白。方法利用多种生物信息学软件分析EgFBPA的拓扑结构、生物学以及免疫功能特征;用限制性内切酶EcoRⅠ和HandⅢ对重组质粒FBPA/P-blue酶切FBPA目的基因片段,亚克隆入表达载体pET30a,筛选重组克隆并测序,将测序正确的重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细菌,用异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白;用Ni-NTA柱纯化重组蛋白,并建立酶反应体系,通过NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的变化测定重组蛋白EgFBPA的酶催化活性。结果 EgFBPA基因全长1 092bp,编码363个氨基酸,软件分析其等电点(pI)为8.34,分子质量单位为39.8035ku。亚细胞定位分析该蛋白为无信号肽的细胞质蛋白,属于稳定蛋白;结构域和保守功能域的预测,FBPAI的激活位点为VYLEGTLLKPN(222aa-232aa),并含有TIMβ/α筒状结构(6aa-346aa),二级结构以α-螺旋和环状结构居多,无跨膜区,有10种类型的活性位点。经PCR、双酶切和测序证实pET30a(+)-EgFBPA构建成功。SDS-PAGE检测重组质粒表达产物分子质量与预期相符,且具有可溶性;Bradford法测定蛋白浓度为(0.50±0.02)mg/ml。酶活性检测Ni-NTA柱纯化后的FBPA具有良好的酶促活性,且存在量效关系。结论生物信息学预测EgFBPA可能是潜在的药物靶点。重组质粒Pet30a(+)-FBPA在大肠埃希菌BL21中成功表达,表达产物具有酶促活性,为进一步研究其生物学功能及药物靶点奠定了基础。
- 王绚吴巨龙吕刚苏娟辛奇鲁俊张思王猛孙萃平逯召莲何黎黎景涛
- 关键词：细粒棘球绦虫蛋白纯化分子克隆生物信息学
- 氯舒隆和奥硝唑体外抗细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴的效果评价
- 2018年
- 目的研究氯舒隆和奥硝唑体外抗细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴的效果。方法从感染细粒棘球蚴绵羊肝脏中收集原头节;从感染长爪沙鼠腹腔中分离多房棘球蚴,加入预先接种人肝癌细胞的DMEM培养基中培养2个月后,收集直径为1~5 mm囊泡。实验分氯舒隆组(实验组)、奥硝唑组(实验组)、阿苯达唑组(阳性对照)和0.2%二甲基亚砜(DMSO)组(溶剂对照组)。每种药物设2个平行孔,终浓度均为40μmol/L,重复2次。每孔加细粒棘球蚴原头节约100个或多房棘球蚴囊泡25~35个。药物处理细粒棘球蚴原头节24、48、72、96、120、144和168 h后,显微镜下观察原头节形态,用台盼蓝染色,计算原头节存活率,组间存活率的比较采用方差分析。药物处理多房棘球蚴囊泡36 h和120 h后,显微镜下观察囊泡的形态学改变,测定培养上清液中碱性磷酸酶的活性,组间酶活性的比较采用卡方分析。结果氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑作用于原头节后,原头节颜色变深、钙颗粒减少、头钩脱落、头节外翻并伸长,0.2%DMSO对原头节形态无影响。氯舒隆、臭硝唑和阿苯达唑作用24、48、72、96、120、144和168 h后,原头节存活率分别为79%、70%、56%、42%、33%、16%、15%,86%、67%、63%、48%、32%、28%、21%和85%、71%、45%、36%、21%、15%、8%;0.2%DMSO组原头节存活率为100%。氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑组原头节存活率与0.2% DMSO组相比差异均有统计学意义(χ~2=147.83、130.58、170.37,P<0.05)。氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑作用后,多房棘球蚴囊泡均塌陷、皱缩,0.2%DMSO对多房棘球蚴囊泡形态无影响。作用36 h后氯舒隆、奥硝唑、阿苯达唑和0.2% DMSO组培养上清液碱性磷酸酶的吸光度(A405)值分别为0.196±0.030、0.186±0.004、0.244±0.049和0.131±0.020,作用120 h后分别为0.431±0.006、0.271±0.004、0.423±0.007和0.116±0.004。氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑组与0.2%DMSO组相比差异均有
- 辛奇高海军宋晓霞孙旭东吕薇Nabil PERVAIZ鲁俊景涛
- 关键词：多房棘球蚴奥硝唑
- 白黎芦醇体外对多房棘球蚴原头节和微囊的作用研究被引量：1
- 2021年
- 目的研究白藜芦醇(Resveratrol,RES)体外对多房棘球蚴原头节(Protoscoleces,PSCs)和微囊的作用效果,为多房棘球蚴病的临床用药提供新的依据。方法PSCs体外经不同浓度(5、10、20、40、80、100、200和400μmol/L)的RES作用7 d,采用台盼蓝染色观察其活力与形态变化,采用扫描电镜和透射电镜观察其超微结构变化,运用化学发光法检测上清中碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性;微囊体外经RES(40μmol/L)作用14 d后于光镜下观察其活力和形态变化,运用化学发光法检测上清中ALP活性。结果不同浓度的RES体外持续作用7 d,PSCs死亡率呈剂量、时间依赖性增高,并伴随大量小钩脱落。当40μmol/L RES作用至第6 d,PSCs死亡率达到100%,且虫体小钩、吸盘和外皮等超微结构被破坏;在同条件下,阿苯达唑亚砜(Albendazole sulfoxide,ABZ-SO)处理组中PSCs死亡率为13.25%±1.41%,对照组-二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)组PSCs死亡率仅为6%±0.71%。不同浓度的RES作用至第6 d,PSCs培养上清中ALP活性呈剂量依赖性升高(F=36.94,P<0.001),其中,RES浓度为20和40μmol/L时,上清中ALP活性分别为(2.72±0.24)U/L和(2.95±0.10)U/L,分别与DMSO组(1.97±0.18)U/L间差异存在统计学意义(t=2.94,P=0.0259和t=7.066,P=0.0004)。另外,RES作用至14 d,微囊透光性降低,生发层皱缩且与角质层分离,同时上清中ALP活性(2.74±0.15)U/L高于较DMSO组(2.08±0.09)U/L(t=3.83,P=0.019),但ABZ-SO组(2.29±0.14)U/L与DMSO组间差异无统计学意义(t=1.271,P=0.273)。结论白藜芦醇体外可抑制多房棘球蚴原头节和微囊的活性,有望成为治疗多房棘球蚴病的潜在候选药物。
- 高海军庞华胜张妍霍乐乐姜斌莫筱瑾雒艳萍张颋景涛徐斌马兴铭胡薇
- 关键词：白黎芦醇多房棘球蚴原头节微囊碱性磷酸酶
- 细粒棘球绦虫GAPDH蛋白的生物信息学分析及其重组表达纯化和酶活性检测被引量：1
- 2014年
- 目的以生物信息学预测细粒棘球绦虫甘油醛3-磷酸脱氢酶(EgGAPDH)编码基因及其编码蛋白的结构和功能,利用大肠杆菌原核表达系统高效表达EgGAPDH重组蛋白,体外检测其酶活性。方法运用各软件对EgGAPDH的理化性质、保守功能域、系统发生树和二级结构、三级结构等方面进行分析后,将EgGAPDH基因亚克隆于表达载体pET30a(+),转化入E.coli BL21(DE3)感受态细菌,表达、纯化重组蛋白,并利用底物3-磷酸甘油醛测定重组蛋白EgGAPDH的酶催化活性。结果 EgGAPDH cDNA序列长度为1 011bp,编码一个336个氨基酸的蛋白。该GAPDH蛋白理论相对分子质量为36 128.3Da,等电点为8.44,具有GAPDH蛋白家族的两个功能结构域,富含6种类型的特定功能位点。成功构建的原核表达载体pET30a(+)-EgGAPDH在E.coli BL21(DE3)中高效表达,且发现表达产物主要以可溶形式分布于裂解上清,制备甘油醛3-磷酸脱氢酶纯品并通过酶活检测显示其具有高效酶活性。结论 EgGAPDH基因可在原核系统中获得有酶催化活性的高效表达,为进一步研究其在糖代谢中的功能奠定了基础。
- 吴巨龙王绚吕刚苏娟逯召莲孙萃萍景涛
- 关键词：细粒棘球绦虫生物信息学原核表达酶活性检测
- 细粒棘球绦虫转醛醇酶基因的克隆、表达及其潜在免疫诊断价值的研究被引量：7
- 2017年
- 目的对细粒棘球绦虫转醛醇酶(Echinococcus granulosus transaldolase,EgTAL)编码基因进行生物信息学分析、克隆和表达,并对其作为药物靶标及其潜在的免疫诊断价值进行初步评价。方法运用多种软件分析EgTAL的理化性质、保守功能域、同源性和三级结构等。从重组质粒pBluescript ⅡSK Egtal中PCR扩增Egtal基因,克隆至pET30a,构建表达载体pET30a-Egtal,转化大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物,抗His标签镍亲和层析柱纯化重组蛋白EgTAL,与细粒棘球蚴病患者血清进行蛋白质印迹(Western blotting)分析。用20份已确诊的细粒棘球蚴病患者血清和20份健康者血清,ELISA法评价重组蛋白EgTAL的免疫诊断效果。分光光度法检测重组蛋白EgTAL的酶活性。结果 Egtal基因长981 bp,编码的蛋白含326个氨基酸,理论相对分子质量(M_r)为36 332,等电点为5.11,含TAL标识序列DATTNPSLI(31~39 aa)及酶活性催化部位,EgTAL与人TAL的同源性为62%。三级结构分子建模显示,EgTAL具有A和B两条完整的蛋白链。成功构建重组质粒pET30a-Egtal。SDS-PAGE和Western blotting分析结果显示,重组蛋白EgTAL在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,在M_r36 332处可见重组蛋白EgTAL条带,主要以可溶性形式存在,EgTAL可被细粒棘球蚴病患者血清识别。ELISA分析结果显示,20份细粒棘球蚴病患者血清和20份健康者血清的平均A_(450)值分别为1.189±0.384和0.325±0.078,其中17份细粒棘球蚴病患者血清检测结果为阳性。酶活性检测结果显示,纯化后的EgTAL具有高效酶活性,60μg EgTAL加入酶促反应体系催化反应30 min后,体系的吸光度(A_(340)值)由1.684±0.103降至0.139±0.009。结论克隆了细粒棘球绦虫Egtal基因,并在E.coli BL21(DE3)中表达出有酶催化活性和潜在免疫诊断价值的EgTAL重组蛋白。
- 辛奇景涛宋晓霞高海军孙旭东吕薇Nabil Pervaiz鲁俊
- 关键词：细粒棘球绦虫克隆表达免疫诊断药物靶点
- 多房棘球蚴感染对长爪沙鼠肝脏药物代谢酶活性的影响被引量：1
- 2016年
- 目的研究多房棘球蚴感染对长爪沙鼠肝脏药物代谢酶活性的影响。方法将10只长爪沙鼠随机均分为2组,实验组每鼠腹腔接种多房棘球蚴囊组织匀浆300μl(约含600个原头节),对照组每鼠给予等量生理盐水。感染后5个月,颈椎脱臼法处死沙鼠,取出肝脏,以差速离心法制备肝微粒体悬液和细胞液。采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量分析试剂盒测定细胞液和微粒体悬液的蛋白浓度。用差示光谱法测定肝微粒体中细胞色素P450(CYP450)和细胞色素b5(Cyt b5)的含量。荧光分光光度法测定7-乙氧基试卤灵脱乙基酶(EROD)和7-甲氧基试卤灵脱甲基酶(MROD)的活性。紫外-可见光分光光度法测定NADPH-细胞色素C还原酶(NCR)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)和黄素单加氧酶(FMO)的活性。结果实验组细胞液和肝微粒体悬液的蛋白浓度为(11.089±1.277)和(3.212±0.924)mg/ml,对照组的分别为(12.459±1.625)和(3.894±0.395)mg/ml。实验组肝微粒体CYP450和Cyt b5的含量为(0.508±0.142)和(0.515±0.077)nmol/mg蛋白,明显低于对照组[(0.647±0.090)和(0.596±0.051)nmol/mg蛋白](P<0.05)。实验组细胞液GST活性为(1.766±0.339)×103 nmol/(mg·min),明显低于对照组[(2.001±0.160)×103 nmol/(mg·min)](P<0.05);实验组肝微粒体FMO和NCR的活性分别为(1.142±0.327)和(0.602±0.162)×103 nmol/(mg·min),明显高于对照组[(0.882±0.150)和(0.442±0.082)×103nmol/(mg·min)](P<0.05);而肝微粒体EROD和MROD的活性与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论长爪沙鼠感染多房棘球蚴后,肝微粒体FMO和NCR活性明显升高,GST活性明显降低。
- 李焕平辛奇鲁俊袁苗苗Nabeel PERVAIZ景涛
- 关键词：多房棘球蚴长爪沙鼠药物代谢酶比色法
