国家自然科学基金(31302096)
- 作品数：24 被引量：36H指数：3
- 相关作者：王安平朱善元左伟勇洪伟鸣王永娟更多>>
- 相关机构：江苏农牧科技职业学院扬州大学甘肃农业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省“六大人才高峰”高层次人才项目江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 鸭源新城疫病毒F基因在昆虫细胞中的表达和鉴定被引量：2
- 2015年
- 为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV)F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。
- 王安平朱善元王永娟吴双左伟勇洪伟鸣
- 关键词：鸭源新城疫病毒F基因昆虫细胞
- 番鸭细小病毒样颗粒的制备与鉴定被引量：4
- 2019年
- 为在昆虫细胞中表达番鸭细小病毒主要结构蛋白VP3,并探讨重组蛋白VP3能否在昆虫细胞中自动组装成病毒样颗粒,高保真扩增VP3基因,克隆入杆状病毒转移载体pFastBac1中,获得重组转移质粒pFB-VP3,转化DH10Bac感受态细胞,经抗性、蓝白斑筛选及PCR鉴定,得到重组Bacmid DNA。将其转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒rBac-VP3,利用SDS-PAGE、Western-blot、间接免疫荧光试验对重组蛋白的表达情况进行检测,负染电镜观察病毒样颗粒,并通过Western-blot对病毒样颗粒进行鉴定。SDS-PAGE和Western-blot结果表明重组蛋白大小正确。间接免疫荧光试验结果显示,重组蛋白获得了成功表达。利用负染电镜可观察到直径约20 nm的典型二十面体病毒样颗粒。Western-blot结果显示该病毒样颗粒由VP3蛋白组成。本研究首次成功利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统制备了番鸭细小病毒样颗粒,为番鸭细小病毒病新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。
- 王安平吴萌吴海涛顾玲玲朱善元
- 关键词：番鸭细小病毒病毒样颗粒
- 重组禽腺联病毒介导的人溶菌酶在蛋清中的表达
- 2018年
- 为在鸡蛋清中表达人溶菌酶(hLYZ),将含有hLYZ输卵管特异表达盒的重组禽腺联病毒以每只鸡2×10^(11)经翅静脉注射正常产蛋母鸡,收集蛋清对重组蛋白的表达情况进行检测。RT-PCR结果显示,hLYZ只在输卵管部位表达,Western blot结果显示重组蛋白大小正确,抑菌活性表明注射重组病毒后的蛋清的抑菌活性明显优于正常蛋清的。动态表达水平检测结果显示,注射病毒后第1周即可以检测到重组hLYZ的表达,第5周时表达量最高,达68.3μg/mL,表达时间持续3个月之久。以上结果表明,重组禽腺联病毒能介导人溶菌酶在蛋清中的高效、长时表达,为人溶菌酶的开发应用提供了新途径。
- 吴植朱善元顾玲玲张继玲吴萌崔潇婷王安平
- 关键词：人溶菌酶蛋清
- 鸭肝炎病毒Ⅰ型VP35'端截短基因的原核表达
- 2014年
- 鸭病毒性肝炎（ Duck viral hepatitit,DVH）是一种由鸭肝炎病毒（ Duck hepatitis virus,DHV）感染导致的急性和高度致死性传染病,可引起21日龄以下的雏鸭发生急性肝炎,有的可能腹泻,病死率高达100%,是严重危害养鸭业的疫病之一。 DHV 主要包括3个血清型,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。3个血清型有明显的差异,无交叉免疫性。目前中国发生和流行的主要是Ⅰ型鸭肝炎病毒（ DHV-Ⅰ）[1]。该病毒属于小 RNA病毒科,为无囊膜的单股正链RNA病毒[2-3],其基因组大小约为7690 nt,具有1个开放阅读框,编码2249个氨基酸的聚合蛋白质。该聚合蛋白质经蛋白酶水解可产生11种蛋白质,即 VP0、VP1、VP3、2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D[4]；其中 VP3蛋白质位于衣壳表面,是 DHV 重要的结构蛋白质之一。DHV-1和人肠道病毒（ Human parechovirus,HPeV）同属于小RNA病毒科,其中HPeV VP3蛋白质的N-末端约20个氨基酸的区域具有很强的免疫原性[5],有文献报道 DHV-ⅠVP3蛋白质在该区域有较高的表面可及性、亲水性值和抗原指数,同样具有较强的免疫原性[6]。
- 张继玲朱善元王安平刘俊王岑左为勇洪伟明
- 关键词：VP3基因原核表达DUCKHEPATITISVIRUS
- Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒3C基因在昆虫细胞的表达与检测
- 2017年
- 利用杆状病毒表达系统进行Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒蛋白水解酶3C基因的表达研究。首先通过PCR方法扩增出3C基因,亚克隆至杆状病毒转移载体p Fast Bac1中,获得重组转座载体p FB-3C,随后将该重组质粒转化感受态细胞DH10Bac进行同源重组,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后,获得重组杆状病毒穿梭质粒r Bacmid-3C,将其在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒r Bac-3C,并进行重组蛋白表达的检测。间接免疫荧光结果,鸭抗全病毒阳性血清能够与重组蛋白发生特异性结合。结果表明,DHAV-Ⅰ3C蛋白在sf9昆虫细胞中获得了成功表达。
- 吴植顾玲玲朱善元王安平
- 关键词：C基因昆虫细胞
- 1型鸭甲型肝炎病毒3D基因的原核表达与多抗制备被引量：1
- 2015年
- 根据血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3D基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增3D基因,将其克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为68 k D,Western blot分析显示该重组蛋白能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将切胶后纯化的目的蛋白免疫ICR小鼠,制备针对重组蛋白的多抗血清,Western blot结果显示制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,3D基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于3D蛋白的检测,为3D蛋白的功能研究奠定了基础。
- 王安平朱善元吴双
- 关键词：3D基因原核表达抗血清
- 环介导等温扩增技术及其在动物疫病检测中的应用被引量：2
- 2015年
- 环介导等温扩增(LAMP)是一门新兴的分子生物学检测技术,因其具有高特异性、高灵敏度、简便快捷、成本低廉等特点,受到越来越多兽医工作者的关注。目前,该方法已经广泛应用于各种病原微生物的检测。本文就环介导等温扩增技术的原理、方法、应用等方面进行简述,最后指出LAMP当前存在的一些不足之处,并对其发展前景进行了展望,以期为其临床应用提供理论依据。
- 胡成成大荣余树培赵方苏玲玲蔡树东顾玲玲王永娟
- 关键词：动物疫病
- Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：2
- 2017年
- 根据已经发表的Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因序列,设计1对特异性引物(上下游分别插入Bam H I和Sac I酶切位点),利用PCR技术扩增出VP1基因,经Bam H I和Sac I双酶切后,将其克隆至原核表达载体p ET-32a上,获得重组表达质粒p ET-VP1。重组质粒转化感受态细胞E.coli BL21(DE3),重组蛋白经IPTG诱导成功表达。将重组蛋白切胶免疫6周龄的BALB/c小鼠,3次免疫后采血,制备DHV-Ⅰ的多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示,成功表达出的重组蛋白分子量约为46 000。Western-blotting分析结果表明,该重组蛋白可与His组氨酸鼠单克隆抗体发生特异性反应,Western-blotting检测抗鼠DHV多抗的结果显示,DHV多抗能与目的蛋白发生特异性反应。以上结果表明,DHV的VP1蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的DHV多抗能用于VP1蛋白表达的检测。
- 顾玲玲朱善元成大荣左伟勇洪伟鸣蔡树东王安平
- 关键词：VP1基因原核表达多克隆抗体
- 单增李斯特菌Hly基因的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：4
- 2017年
- 为获得单增李斯特菌溶血素(Listeriolysiono,LLO)蛋白及其多克隆抗体。根据单增李斯特菌溶血素蛋白的基因Hly序列设计了一对特异性引物,扩增出Hly基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,并转化于大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的作用下重组LLO蛋白成功表达。SDS-PAGE结果表明重组蛋白分子量约为69.3 ku,且主要以包涵体形式表达LLO蛋白。将重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗LLO抗体。Western-blot检测到一条约69.3 ku的特异性条带,表明该抗体具有较强的特异性。单增李斯特菌溶血素基因Hly在大肠杆菌中已成功表达,且制备的多克隆抗体可用于LLO蛋白的检测。
- 洪伟鸣宋亮左伟勇
- 关键词：单增李斯特菌原核表达多克隆抗体
- Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因在杆状病毒表达系统中的表达被引量：2
- 2017年
- 为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株的结构蛋白VP0,首先根据DHAV-Ⅰ SH株VP0基因序列设计一对引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,亚克隆至杆状病毒转移载体pFast Bac1,获得重组质粒p FB-VP0,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP0,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP0。Western-blot结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为29 k D,间接免疫荧光结果显示重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。研究结果表明,DHAV-Ⅰ SH株的结构蛋白VP0在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP0结构蛋白的功能研究和基因工程疫苗的研制奠定了基础。
- 王安平顾玲玲王永娟吴双左伟勇洪伟鸣朱善元
- 关键词：昆虫细胞
