国家高技术研究发展计划(2006AA100306)
- 作品数：27 被引量：123H指数：6
- 相关作者：绳秀珍战文斌刘荭邢婧黄倢更多>>
- 相关机构：中国海洋大学深圳出入境检验检疫局中国水产科学研究院黄海水产研究所更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家质检总局科技计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒的特异性抗体被引量：5
- 2007年
- 应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4,通过间接酶联免疫法(ELISA)对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒(LCDV)特异性抗体进行了检测。结果表明:无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低(平均OD值为0.092),个别鱼体偏高,证明已感染LCDV,处于潜伏期;患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高(平均OD值为0.165),患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高(平均OD值为0.231);健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后,特异性抗体水平显著升高。
- 李强战文斌绳秀珍邢婧周丽
- 关键词：单克隆抗体牙鲆血清淋巴囊肿病毒特异性抗体
- 中华鳖虹彩病毒单克隆抗体的制备及其抗原表位的初步分析被引量：5
- 2009年
- 以纯化的中华鳖虹彩病毒为抗原免疫Balb／C小鼠，取免疫鼠脾细胞经杂交融合获得了8个能稳定分泌抗中华鳖虹彩病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。单克隆抗体亚级份分析结果表明，Mab2A4属IgA，Mab8E1是IgG2a，其他的6株单抗Mab1D3、Mab2H1、Mab3A1、MaMB5、Mab5E1和Mab6F2均为IgG1。酶联免疫吸附剂测定（ELISA）分析表明，8株单抗均能特异性地识别中华鳖虹彩病毒，与EPC、CO、FHM等宿主细胞不产生交叉反应，腹水抗体的ELISA效价在10^5～10^6。IFA分析表明，8株单抗中仅Mab5E1没有免疫荧光反应特性，其余7株单抗均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色。中和试验结果证实8株单抗均没有中和病毒的特性。应用Western—blotting进行中华鳖虹彩病毒的抗原表位初步分析，结果显示：Mab1D3和Mab2A4分别识别分子量为84ku和35ku中华鳖虹彩病毒结构蛋白，Mab3A1能够同时识别分子量分别为14ku和16ku的两条多肽，说明这3株单抗结合位点是非构象依赖性抗原决定簇，其余单抗不具备Western—blotting反应特性。这些结果提示上述单抗对中华鳖虹彩病毒抗原特异、灵敏，可用于中华鳖虹彩病毒的检测和结构蛋白分析。
- 朱春华刘荭刘晓东杨金先郑在予林天龙
- 关键词：中华鳖虹彩病毒单克隆抗体抗原
- 鱼类神经坏死病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用被引量：9
- 2008年
- 根据GenBank中登录的鱼类神经坏死病毒CP基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光RT-PCR反应条件进行优化,建立了用于检测鱼类神经坏死病毒的实时荧光RT-PCR方法。利用该方法检测鱼类神经坏死病毒及其他多种常见的水生动物RNA病毒,结果只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.2pg/μL的总RNA。与RT-PCR的灵敏度对比试验表明,其敏感度比RT-PCR高100倍。对同一样品进行检测,在组内及组间的变异系数分别为0.9%以及1.5%,证实其重复性极好,并且从抽提核酸到得出结果仅需4h。对临床500份样品进行鱼类神经坏死病毒检测,结果发现有40份阳性样品。这些结果表明,本研究所建立的实时荧光RT-PCR能对鱼类神经坏死病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高的优点,是开展鱼类神经坏死病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。
- 罗卫李惠芳刘荭陈焕春范万红刘宗晓田飞焱王侃吕建强
- 关键词：实时荧光RT-PCR
- 副溶血弧菌tlh基因缺失株的构建
- 2011年
- 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticuss,VP)是我国海水养殖鱼、虾、贝类的重要病原,其主要致病因子热不稳定性溶血素(thermolabile hemolysin,TLH)的功能和致病性仍不十分清楚。本研究利用PCR技术从VP临床分离株的基因组DNA中扩增出tlh基因,利用同源重组技术,构建了副溶血弧菌tlh基因打靶载体;利用PCR方法筛选tlh基因缺失株,并在卵磷脂存在条件下进行溶血性检测,结果在5%兔血平板上能够引起溶血,5%的马血琼脂平板未出现溶血现象,说明tlh基因敲除成功。本研究成功构建了副溶血弧菌tlh基因缺失株,为进一步研究tlh基因致病性和溶血机制提供了必要的实验菌株,为副溶血弧菌其他基因的敲除提供了可行性依据。
- 赵永刚唐小千战文斌
- 关键词：副溶血弧菌同源重组基因敲除溶血活性
- 鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定被引量：4
- 2011年
- 为获得针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)特异性的单克隆抗体(MAb),以纯化的SVCV为抗原,免疫BALB/c小鼠。将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选获得4个能稳定分泌抗SVCV MAb的杂交瘤细胞株;4个杂交瘤细胞制备腹水的MAb效价为1∶160000～1∶640000。亚型鉴定结果表明,这些MAb分属2个亚型(1F1、3E1,IgG2a;3F5、4F9,IgG1),轻链均为Κ链。Western blot分析显示,MAb1F1、3F5、4F9能特异性地识别SVCV的N蛋白(47ku),3E1能特异性地识别SVCV的G蛋白(69ku)。采用相加ELISA法对抗原表位分析结果显示,1F1、3F5、4F9可能识别相同的表位,3E1则识别不同的表位。间接免疫荧光试验结果显示4株MAb均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色。这些MAb的制备为SVCV免疫学检测方法的建立奠定了基础。
- 张朋刘荭陈孝煊吴志新余剑敏杜娟兰文升史秀杰郑晓聪何俊强贾鹏申斯思朱家增
- 关键词：鲤春病毒血症病毒单克隆抗体N蛋白
- 鱼类病毒性神经坏死病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其特性被引量：8
- 2008年
- 利用RT-PCR技术获得病毒性神经坏死病毒0603株的衣壳蛋白基因,将其插入到杆状病毒Bac-To-Bac表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastBac-cp质粒。转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-cp,脂质体介导将其转染Sf9细胞产生有感染性的重组杆状病毒AcNPV-cp。利用AcNPV-cp感染Sf9细胞后,SDS-PAGE分析可见大小约为37ku的特异性蛋白带,Western-blotting分析发现,其可以与病毒性神经坏死病毒阳性血清反应出现特异性的杂交带。试验结果表明,AcNPV-cp在Sf9细胞中成功地表达了病毒性神经坏死病毒的衣壳蛋白,其具有良好的免疫学活性。负染电镜观察发现,CP蛋白可自行装配成病毒样颗粒,其大小形态类似于病毒性神经坏死病毒。制备超薄切片后电镜观察发现,CP蛋白自行装配成的病毒样颗粒呈晶格状排列在细胞质中。为研制有效防控鱼类病毒性神经坏死病的新型颗粒性疫苗奠定了基础。
- 罗卫田飞焱刘荭陈焕春李惠芳刘宗晓王侃蔡伊娜吕建强
- 关键词：衣壳蛋白病毒样颗粒
- 细胞凋亡信号途径与免疫系统之间的串流被引量：2
- 2008年
- 细胞凋亡作为一种生命体的主要细胞死亡方式,在清除多余或受感染细胞中发挥重要作用。尽管在组织或胚胎正常发育过程中,细胞凋亡诱导免疫反应比较温和,但在病毒感染或者对死亡受体(death receptor,DR)进行刺激时凋亡可以触发强烈的天然和获得性免疫反应。凋亡信号途径中的分子与免疫系统有着复杂的相互作用。本文综述了有关凋亡性死亡在诱导炎症,维持免疫系统动态平衡,促进免疫应答以及凋亡信号途径和免疫系统抗病毒机制相互关系等方面的研究成果,分析细胞凋亡所诱发免疫效应的机制。
- 肖小强陈新华
- 关键词：细胞凋亡免疫系统胱天蛋白酶
- 核酸检测技术在水产动物病毒感染诊断中的应用被引量：3
- 2008年
- 目前,应用于水产动物病毒感染诊断中的核酸检测技术主要包括核酸杂交、聚合酶链反应、聚合酶链反应与分子杂交联用、聚合酶链反应与免疫学联用、限制性酶切技术、环介导的等温扩增、基因芯片及测序等技术。这些技术发展迅速,并在原有基础上根据实际的需求产生出很多相应的衍生技术。它们已被广泛应用在水产动物病毒感染诊断中并发挥着巨大的作用。核酸检测技术以其无法比拟的优点得到了快速的推广和应用,有着广阔的发展空间。
- 荆晓艳黄倢张士璀
- 关键词：核酸检测技术水产动物病毒
- 血卵涡鞭虫在养殖锯缘青蟹中的寄生被引量：17
- 2007年
- 利用光镜和电镜对2005年9月浙江三门湾地区某养殖场发生的养殖锯缘青蟹规模性死亡病蟹进行观察,并对病原进行分子生物学鉴定。组织病理学研究发现,病蟹蟹体消瘦,肌肉白浊,头胸甲内可见大量乳白色液体,血淋巴细胞的量急剧减少,代之以大量寄生原虫,该原虫在病蟹的肝胰腺、鳃、心脏、肌肉等部位大量寄生,引起这些组织发生以坏死为主的变质性病变。电镜下,乳白色液体及病变组织内可见大量寄生虫体,其形态特征、内部结构及宿主表现的症状,与血卵涡鞭虫相类似。采用Small等[5]的血卵涡鞭虫ITS特异引物,扩增出分子量为300 bp左右的条带,并对其进行了测序及序列相似性比较,确定该寄生原虫为一种血卵涡鞭虫Hematodiniumsp。血卵涡鞭虫是海水甲壳类的重要病原寄生虫,我国尚未有该寄生虫病的研究报道,文中首次发现其在养殖锯缘青蟹中的寄生,为靳一步研究该寄生虫病积累了资料。
- 许文军绳秀珍徐汉祥施慧李鹏飞
- 关键词：锯缘青蟹血卵涡鞭虫组织病理学分子生物学
- 6种海洋致病性弧菌36kDa外膜蛋白特性分析被引量：12
- 2009年
- 研究本着筛选和制备弧菌共同外膜蛋白亚单位疫苗,用十二烷基肌氨酸钠抽提并结合超速离心的方法提取了鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、鱼肠道弧菌(V.ichthyoenteri)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.para-haemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)和创伤弧菌(V.vulnificus)6种海洋致病性弧菌的主要外膜蛋白,SDS-PAGE图谱比较发现这6种弧菌都存在36kDa的外膜蛋白条带。通过电泳洗脱分离纯化这6种弧菌的36kDa外膜蛋白,并制备了鳗弧菌菌株SJ060621的36kDa外膜蛋白多抗。ELISA和Western-blot印迹结果显示,仅鳗弧菌SJ060621、S010610-1和哈维氏弧菌的36kDa外膜蛋白存在免疫交叉反应;双向电泳分析了鳗弧菌SJ060621、S010610-1、哈维氏弧菌和溶藻弧菌的36kDa外膜蛋白,2-DE图谱显示出鳗弧菌SJ060621和S010610-1均由3种等电点相近的蛋白组成,存在很高的同源性,2株鳗弧菌与溶藻弧菌和哈维氏弧菌在蛋白质组成数量和等电点上都存在较大的差异,结果说明通过主要外膜蛋白的分子量和免疫特性研究,可为筛选不同弧菌共同外膜蛋白的亚单位疫苗提供有利参考。
- 唐小千战文斌周丽绳秀珍
- 关键词：弧菌外膜蛋白抗原性双向电泳
