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携带AIVHA基因鸭肠炎病毒转移载体的构建被引量：1: 2011年; 为了获得携带禽流感病毒(AIV)HA基因鸭肠炎病毒转移载体,试验采用基因工程方法构建了带有CMV启动子、多克隆位点(MCS)及牛生长因子转录终止信号和加poly(A)信号(BGHpA)等真核表达元件的载体pET-3.1,将H5N1亚型禽流感病毒HA基因插入pET-3.1,再将携带真核表达元件的HA基因插入鸭肠炎病毒通用转移载体pUC-TK-LacZ-2中TK基因的XhoⅠ位点。结果表明:获得了携带AIV HA基因的鸭肠炎病毒转移载体。; 马波邢明伟刘晓玫乌伊罕韩先杰王君伟; 关键词：鸭肠炎病毒 HA基因

禽流感病毒M1抗体间接阻断ELISA检测方法的建立被引量：4: 2009年; 以禽流感病毒(AIV)重组M1蛋白作为检测抗原,兔抗M1血清为阻断抗体,建立了检测AIVM1抗体的间接阻断ELISA方法。经筛选确定,抗原最佳包被浓度为0.78μg/mL,阻断抗体最佳稀释度为1∶15000,待检血清最佳稀释度为1∶10。用该ELISA方法对38份AIV阳性禽类样本和26份AIV阴性禽类样本进行检测,结果显示,该方法的敏感性为97.37%,特异性为96.15%。交叉试验证明该方法与新城疫等8种其他禽病阳性血清不发生交叉反应。用该ELISA方法对268份已知HI效价的临床样品进行检测,结果与HI的符合率达92%以上。表明,建立的间接阻断ELISA方法可用于AIV抗体的检测和禽流感的流行病学调查。; 王兆鹏尚绪增刘思莹马波王君伟; 关键词：禽流感病毒

东北白鹅CD8α基因的克隆及其胞外区基因的表达与抗血清的制备: 2015年; 根据GenBank公布的绿头鸭CD8α(AF378373)基因序列设计引物,通过RT-PCR获得东北白鹅CD8α基因。根据测序结果设计特异性引物,克隆得到东北白鹅CD8α胞外区基因,并在pET-30a(+)及pET-28a(+)/Rosetta(DE3)pLysS系统中进行原核表达。经IPTG诱导重组蛋白质获得表达,Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白质,以纯化的重组蛋白质(pET-30a-CD8ex)为免疫原制备兔抗鹅CD8α胞外区抗血清。I-ELISA、Western blot分析表明抗血清可特异识别分离获得的东北白鹅外周血T淋巴细胞与重组蛋白质(pET-28a-CD8ex),间接免疫荧光试验证实,纯化的抗血清可特异性识别瞬时真核表达的鹅CD8α胞外区蛋白质。利用激光共聚焦显微镜观察到分离获得的鹅外周血淋巴细胞的细胞膜处出现明显的荧光信号。本研究结果说明制备的抗血清可作为鹅CD8+T淋巴细胞的检测试剂。; 张雪莲魏双施刘晓玫邵建伟张树栋李珊珊高明春张文龙邢育钢马波王君伟; 关键词：东北白鹅 CD8Α 基因表达 T淋巴细胞

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白优势抗原区的鉴定及抗体检测ELISA方法的建立被引量：6: 2014年; 为鉴定Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)VP1蛋白优势抗原区及建立DHV-Ⅰ抗体检测ELISA方法,本研究以重组质粒pEasy-VP1为模板,将其分为5段(VP1-a^e)及全长VP1经PCR扩增,并分别克隆于pET-32a(+)进行原核表达。经western blot分析表明,截短表达的蛋白VP1-c(80 aa^150 aa)抗原性良好。将其纯化作为包被抗原建立了DHV-Ⅰ抗体的间接ELISA检测方法。经反应条件优化确定:VP1-c包被浓度为2μg/mL,DHV-Ⅰ抗血清稀释度为1∶20,其临界值为0.208。该方法能够特异性检测DHV抗体,与其他常见的几种鸭病阳性血清无交叉反应;其批内和批间重复性试验变异系数均小于9%。应用建立的ELISA方法对48份鸭血清进行了检测,与中和试验相比较,符合率为86.9%。表明该方法可以初步应用于DHV抗体的检测和血清流行病学调查。; 董井泉张蕾马波师东方王君伟; 关键词：鸭肝炎病毒 VP1蛋白间接ELISA

禽流感病毒NS1抗体间接阻断ELISA检测方法的建立被引量：3: 2009年; 以禽流感病毒(AIV)重组NS1蛋白作为检测抗原,兔抗NS1血清为阻断抗体,建立了检测AIVNS1抗体的间接阻断ELISA方法。经筛选确定,抗原的最佳包被浓度为0.6μg/mL,阻断抗体的最佳稀释度为1∶10000,待检血清最佳稀释度为1∶10。用该方法对42份AIV感染禽类血清样本和50份用AIV灭活疫苗免疫的禽类血清样本进行检测,结果显示,该方法的敏感性为95.2%,特异性为90.0%。交叉反应试验证明,该方法与新城疫等8种其他禽病阳性血清不发生交叉反应。临床检测结果显示,186份AIV灭活疫苗免疫禽血清样本的阴性率为89.2%,20份基因工程疫苗免疫禽血清样本的阴性率为95.0%,42份健康非免疫禽血清样本的阴性率为100%。表明,建立的间接阻断ELISA方法可用于区分AIV自然感染禽和疫苗免疫禽。; 王兆鹏尚绪增孙进华高明春马波王君伟; 关键词：禽流感病毒 NS1蛋白

东北白鹅CD4基因的克隆及其胞外区的表达与抗血清的制备被引量：4: 2014年; 本研究根据GenBank公布的绿头鸭CD4(AF378701)基因序列设计引物,RT-PCR获得东北白鹅CD4基因。根据测序结果设计特异性引物,克隆得到东北白鹅CD4胞外区基因,并在pET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLysS系统中进行原核表达。经IPTG诱导重组蛋白获得表达,Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,以纯化的重组蛋白为免疫原制备兔抗鹅CD4胞外区抗血清。I-ELISA、Western blot和流式细胞仪分析表明抗血清可特异识别重组蛋白以及分离获得的东北白鹅外周血T淋巴细胞,间接免疫荧光试验证实纯化的抗血清可特异性识别瞬时真核表达的鹅CD4胞外区蛋白。以上结果说明制备的抗血清可作为鹅CD4+T淋巴细胞的检测试剂。; 张雪莲魏双施邵建伟母晓宇高明春张文龙马波王君伟; 关键词：东北白鹅 CD4 基因表达 T淋巴细胞

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黑龙江省青年科学基金(QC04C32)