国家自然科学基金(81171783)
- 作品数：10 被引量：21H指数：3
- 相关作者：刘菊英李瑞明王晓勋陈靖宜贺娇更多>>
- 相关机构：太和医院武汉大学湖北医药学院更多>>
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- 厌氧培养箱法建立大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型被引量：2
- 2013年
- 目的探讨建立大鼠心肌细胞H9c2缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤模型的一种新方法。方法实验使用大鼠心肌细胞H9c2,随机分为对照组和实验组,对照组常规培养不做处理,实验组分为缺氧2、4、8、12 h及缺氧后复氧2 h组。缺氧时换不含血清的低糖DMEM培养基,再置入85%N2、10%H2、5%CO2缺氧环境。缺氧后,加入新鲜DMEM培养基,置入二氧化碳培养箱中继续培养2 h。苔盼蓝染色检测细胞存活率,Annexin V/PI染色行流式细胞术检测细胞凋亡率,分光光度法检测培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果大鼠心肌细胞经过H/R处理后,与对照组比,细胞存活率显著下降,LDH含量升高,细胞凋亡率显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用厌氧培养箱法建立大鼠心肌细胞H/R损伤模型简单易行,重复性好。
- 夏中元王宇刘菊英
- 关键词：心肌缺血再灌注损伤缺氧复氧细胞模型
- 联合应用常染色体STR、X-STR和线粒体SNP鉴别缺失双亲姐妹同胞关系被引量：5
- 2014年
- 目的对双亲缺失的姐妹进行同胞鉴定。方法采用chelex-100法提取血液DNA,通过检测常染色体短串联重复序列(short tandem repeat,STR)位点、X染色体STR位点和线粒体单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)进行基因分型,分型结果通过判别函数、ITO法、X染色体STR位点和线粒体SNP分析的方法进行同胞关系判定。结果 39个常染色体等位基因位点的共享基因数为27个,用辨别函数判别归于无关个体;用ITO法计算亲缘关系系数(FSI)为6.95003×10^(-44),判别为无关个体;12个X染色体STR等位基因位点中,有3个X染色体STR位点不匹配,排除姐妹俩来自同一父亲;线粒体SNP的检测显有3个基因座不同,两人来源于不同母系。结论通过联合利用常染色体STR、X染色体STR和线粒体SNP检测技术进行确认两人不是同胞姐妹关系。
- 王晓勋陈敏李瑞明贺娇王彦涛罗银州
- 关键词：亲权鉴定法医遗传学
- 大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的制备及改进被引量：7
- 2012年
- 目的总结并改进大鼠心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)模型的制备方法。方法将SPF级成年雄性SD大鼠60只,随机分为3组,每组20只。分别采用切断第4肋法,切断第2、3、4肋骨牵拉固定结扎线法,不切断肋骨使用小型扩胸器及双移液器枪头套叠代替打结法制备MIRI模型。结果 3种方法模型制备成功率分别为45%、50%、70%,成功率比较差异无统计学意义(P>0.05)。3种方法模型制备时间分别为(7.5±1.2)min、(9.0±1.9)min、(5.9±0.8)min,3组比较差异有统计学意义(P<0.05),方法三组与方法一、二组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。3组大鼠模型制备成功者再灌注后CK-MB值(1215±223)U/L与缺血时CK-MB值(1654±313)U/L比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论不切断肋骨,使用小型扩胸器及双移液器枪头套叠代替打结法制备MIRI模型是目前较优良的模型制备方法。
- 陈靖宜刘菊英
- 关键词：心肌再灌注损伤
- 细胞穿透肽4介导的Cu/Zn SOD对缺氧复氧损伤心肌细胞的影响被引量：1
- 2017年
- 目的评价细胞穿透肽4(又称为蛋白转导结构域4,PTD4)介导的铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤(HRI)的影响。方法用厌氧培养箱[85%氮气(N_2),10%氢气(H_2),5%CO_2]制作大鼠心肌细胞(H9c2)HRI模型,设置HRI组(HRI的细胞培养液中不加任何处理因素),HRI+Cu/Zn SOD组(加入10μmol/L Cu/Zn SOD)、HRI+PTD4-Cu/Zn SOD组(加入10μmol/L PTD4-Cu/Zn SOD),另外以正常培养心肌细胞作为正常对照组,孵育30min后,透射电镜观察心肌线粒体超微结构,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位,末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术检测心肌细胞凋亡。结果 PTD4-Cu/Zn SOD组线粒体损伤程度较HRI组有明显改善。与正常对照组比较,HRI组线粒体膜电位明显下降,PTD4-Cu/Zn SOD组线粒体膜电位低于正常对照组,但与HRI组比较明显恢复。HRI+PTD4-Cu/Zn SOD组心肌细胞凋亡指数[(10.20±2.77)%]较HRI组[(28.40±2.41)%]明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PTD4介导的Cu/Zn SOD可以减轻大鼠心肌细胞的HRI。
- 王宇李清曾文静陈靖宜刘菊英
- 关键词：超氧化物歧化酶细胞穿透肽缺氧心肌
- 蛋白转导结构域4-铜/锌-超氧化物歧化酶融合蛋白的制备及其穿细胞膜的功能研究
- 2018年
- 目的拟构建蛋白转导结构域(PTD)4-铜/锌-超氧化物歧化酶(Cu/ZnSOD)原核表达质粒,纯化制备PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,探讨其穿膜能力。方法设计合成hCu/ZnSOD引物,扩增hCu/ZnSOD cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒PET16b-PTD4进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;获得PET16b-PTD4-Cu/ZnSOD(CDs)原核表达载体,导入感受态E.coli BL21(DE3)中,进行扩增培养,收集菌体,将其裂解离心、Ni_2^+亲和层析、收集目的蛋白。融合蛋白孵育人心肌细胞,免疫荧光法检测融合蛋白穿膜能力。结果通过测序证实实验扩增所得的PTD序列与设计的预期序列一致。设计并简并PTD4-Cu/ZnSOD基因长度为567 bp,通过引物进行正反向测序证实该序列与已被登录的GENBANK中Cu/ZnSOD序列相一致,并构建了相应的原核表达质粒。并在E.coli BL21进行大量表达,最终收集的PTD4-Cu/ZnSOD具有良好水溶性。SDS-page分析显示构建的PTD4-Cu/ZnSOD分子量约为20 kDa,与预期的蛋白分子量20.45 kDa相符合。融合蛋白可以穿透心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性。结论成功地构建了PET16bPTD4-Cu/ZnSOD原核表达质粒,获得了可穿透心肌细胞膜的PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白,为应用Cu/ZnSOD治疗缺血性疾病的研究奠定了基础。
- 王宇刘菊英王贤裕柯昌斌李瑞明王晓勋
- 关键词：蛋白转导结构域心肌细胞
- 新型蛋白转导域PTD4的细胞内转导及其组织分布
- 2016年
- 目的:合成新型蛋白转导域PTD4,研究其细胞内穿膜效应及在体组织分布。方法:设计并采用固相合成法合成新型蛋白转导域PTD4,用FAM(羧基荧光素)进行标记,采用高效液相色谱仪(HPLC)和质谱仪测定其纯度与相对分子质量;采用荧光倒置显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察其在细胞内的穿膜情况;采用裸鼠活体成像观察穿膜肽在体内的组织分布及代谢特性,并切片观察各组织器官的分布情况。结果:合成了新型蛋白转导域PTD4,纯度为95.76%,相对分子质量为1776.5;PTD4在体外的穿膜效应有时间与浓度依赖性,约24 h代谢完毕,且共聚焦显微镜细胞层扫证实穿膜肽进入胞内;尾静脉注射的PTD4在裸鼠体内可迅速分布于各组织器官,但组织分布不均一,且有时间与浓度依赖性,6 h后荧光强度下降了大半,且腹腔注射方法不如尾静脉注射的穿膜效率高。结论:采用Fmoc固相肽合成法可成功合成蛋白转导域PTD4;PTD4能高效穿透细胞膜,穿膜效应呈时间与浓度依赖性;PTD4在体内能迅速分布于各组织细胞。
- 史若诗姚万军唐哨群柯昌斌刘菊英
- 关键词：蛋白转导固相合成
- 鄂西北及周边地区汉族人群D2S1338和D19S433基因座多态性分析与调查被引量：1
- 2015年
- 目的采集鄂西北及周边地区汉族人群无关个体血样,进行STR等位基因座D2S1338和D19S433多态性分析。方法应用chelex提取DNA,AmpFISTR Identifiler试剂盒扩增,毛细管电泳分型。结果在被检测的387位无关个体中等位基因座D2S1338和D19S433分别检出14和17个等位基因型以及两个等位基因的分布频率,基因座等位基因分布频率符合Hardy-Weinberg平衡。结论得到一些适合本地区应用的等位基因的频率,为以后司法物证鉴定工作提供参考。
- 王晓勋李瑞明陈敏贺娇尹霞胡巧林梅俊吴慧超
- 关键词：STR等位基因频率统计分析
- PTD4-Cu/Zn SOD融合蛋白对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响被引量：4
- 2017年
- 目的:评价细胞穿透肽4即蛋白转导结构域4(PTD4)介导的铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤(HRI)的影响。方法:用厌氧(85%N2、10%H2、5%CO2)培养箱制作大鼠心肌细胞(H9C2)HRI模型,设置HRI组(HRI的细胞培养液中不加任何处理因素)、HRI+Cu/Zn SOD组(加入10μmol·L-1Cu/Zn SOD)、HRI+PTD4-Cu/Zn SOD组(10μmol·L-1PTD4-Cu/Zn SOD),另外以正常培养心肌细胞作为正常对照组,孵育30 min后,末端脱氧核苷酸转移酶(Td T)介导的d UTP缺口末端标记(TUNEL)技术检测心肌细胞凋亡,蛋白印迹法检测心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果:HRI+PTD4-Cu/Zn SOD组心肌细胞凋亡指数[(10.20±2.77)%]比HRI组[(28.40±2.41)%]明显降低,与HRI组比较,HRI+PTD4-Cu/Zn SOD融合蛋白能显著增加Bcl-2蛋白表达,降低Bax蛋白表达。结论:PTD4-Cu/Zn SOD融合蛋白可以减轻大鼠心肌细胞的HRI。
- 王宇刘菊英曾文静陈靖宜李清
- 关键词：超氧化物歧化酶细胞穿透肽缺氧心肌细胞
- 高效hCu,Zn-SOD-PTD融合蛋白的表达及其穿膜功能的研究被引量：3
- 2016年
- 目的探讨h Cu,Zn-SOD-PTD融合蛋白的表达及其穿膜功能。方法首先,人工设计合成蛋白转导域序列(protein transduction domain,PTD),以人胚肝组织的总RNA为模板,逆转录扩增得人铜锌超氧化物歧化酶全长c DNA序列。其次,将此序列及人工合成PTD序列定向插入p ET16b载体;测序鉴定后,将构建成功的重组载体导入E.coli BL21菌株,异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,经镍柱纯化,洗脱液经SDS-PAGE检测。最后,将纯化产物与食管癌细胞(EC9706)共孵育,用激光共聚焦和流式细胞仪的方法检测蛋白穿膜能力及活性。结果测序结果与人铜锌超氧化物歧化酶全长c DNA序列相符;SDS-PAGE结果出现18.6 kd和20 kd的目的条带;激光共聚焦和流式细胞仪的方法显示蛋白可穿膜且保持活性。结论本实验成功构建了PET16b/h Cu,Zn-SOD-PTD原核表达质粒,可在大肠杆菌中稳定表达融合蛋白,融合蛋白具有穿膜且保持活性。
- 王晓勋杞少华李瑞明梁清乐
- 关键词：蛋白转导域生物膜原核表达载体
- 远端缺血处理心脏保护作用的研究进展
- 2016年
- 1986年,Murry等首次发现,在心脏长时间缺血前,先经过4次5 min短暂的非致命性缺血处理,可以有效地保护心脏,提升对随后长时间致命性缺血的耐受能力,并将这种内源性保护机制称为心肌缺血预处理（ischemic preconditioning,IPC）。
- 夏中元刘菊英史若诗
- 关键词：心脏保护作用心肌缺血预处理心肌保护内源性保护机制心肌梗死面积氧化应激反应
