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国家高技术研究发展计划(2006AA02Z456): 作品数：12 被引量：43H指数：4; 相关作者：杨松涛夏咸柱王承宇王化磊江禹更多>>; 相关机构：军事医学科学院吉林大学吉林农业大学更多>>; 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金国家科技支撑计划更多>>; 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>

狂犬病病毒和犬瘟热病毒疫苗株混合感染Vero细胞的实验研究被引量：2: 2008年; 目的研究狂犬病病毒(RV)及犬瘟热病毒(CDV)共同感染Vero细胞及混合感染对产毒量的影响,比较病毒检测方法的敏感性。方法将单独培养的RV、CDV及RV-CDV混合培养物进行连续10倍稀释后同步接种Vero细胞,37℃5%CO2培养5d,分别以直接免疫荧光(DFA)、RT-PCR及荧光定量RT-PCR方法检测病毒的半数细胞感染量,并对各病毒检测方法进行比较。结果RV和CDV可同时感染Vero细胞,并在其中增殖。CDV单独感染Vero细胞的TCID50为10-5.8/0.05ml,RV和CDV混合感染Vero细胞的TCID50为10-5.5/0.05ml。DFA、RT-PCR和荧光定量RT-PCR阳性的RV-CDV感染最大稀释度分别为10-6、10-5和10-6。结论混合培养对RV和CDV的感染滴度及产毒量影响很小。免疫荧光灶检测与RT-PCR及荧光定量RT-PCR方法检测的敏感性相当。犬瘟热-狂犬病毒联合疫苗的病毒滴度检测可不经中和其中的一个病毒直接将联合疫苗接种Vero细胞,然后分别进行免疫荧光检测。; 王化磊杨松涛郑学星苏建青王承宇赵柏林岳妙姝薛琳夏咸柱; 关键词：犬瘟热病毒狂犬病毒病毒滴度

狂犬病病毒重组免疫毒素的表达及其生物活性鉴定被引量：1: 2008年; 将狂犬病病毒中和性单链抗体基因克隆入原核表达载体pET-PE40,经酶切鉴定及序列测定,成功构建了重组免疫毒素原核表达载体。IPTG诱导后目的蛋白获得高效表达,SDS-PAGE分析目的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于菌体中,表达量占菌体总蛋白的32.29%。包涵体蛋白经体外复性及离子交换色谱柱、疏水作用色谱柱、Sephadex G200凝胶过滤层析柱三步纯化后获得纯度大于96%的目的蛋白,间接免疫荧光染色检测表明重组免疫毒素与狂犬病病毒感染细胞具有抗原结合活性,MTT试验显示,重组免疫毒素对狂犬病病毒感染细胞具有明显的杀伤作用,而对正常细胞无杀伤作用。; 王化磊王承宇杨松涛冯娜郑学星李群苏建青朱平夏咸柱; 关键词：重组免疫毒素狂犬病病毒糖蛋白细胞毒作用

狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth疫苗株反向遗传系统的建立被引量：4: 2009年; 【目的】建立狂犬病毒的反向遗传系统,为研制不含狂犬病病毒致病性的新型安全高效的狂犬疫苗提供技术依据。【方法】本研究采用反向遗传学方法和分子克隆技术,建立了狂犬病病毒Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)疫苗株的CMV/T7、T7启动子病毒拯救系统,构建了表达N、P、L蛋白的辅助质粒。【结果】成功拯救出野生型病毒rERA-VC,在Vero细胞上的生长动力学特性与父母本ERA相同,第三代可在Vero细胞上可获得很高的生长滴度。【结论】建立了狂犬病病毒的反向遗传系统,拯救出的野生型病毒生物学特性与父母本相同。; 郭利冯娜杨松涛王喜军葛金英夏咸柱步志高; 关键词：狂犬病毒反向遗传系统

犬群免疫国产狂犬病弱毒疫苗后的血清流行病学调查分析: 运用OIE推荐的检测犬狂犬病血清抗体的ELISA检测试剂盒,对从广州市某区采集的71份免疫犬血清进行了狂犬病毒血清抗体的定量检测。结果71份血清中,只有9份血清达到了0.6EU以上。抗体合格率为12.7%。结果表明虽然疫...; 向华黄元王贵平宣华江禹扈荣良夏咸柱涂长春; 关键词：狂犬病弱毒疫苗血清流行病学; 文献传递

反向遗传学技术及其在狂犬病病毒研究中的应用被引量：2: 2008年; 反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术,已广泛应用于生命科学研究的各个领域。本文综述反向遗传学技术研究进展,并讨论该技术在狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)研究中的应用。; 郑学星夏咸柱杨松涛王化磊孙培录; 关键词：反向遗传学全长CDNA 狂犬病病毒

狂犬病人源二硫键稳定单链抗体融合蛋白的构建及活性检测被引量：4: 2011年; 【目的】构建、表达人源二硫键稳定单链抗体(scdsFv),检测其生物活性,以获得对狂犬病病毒有特异结合能力及中和活性的scdsFv蛋白。【方法】从GenBank上获得RV单抗SO57重链可变区VH和轻链可变区VL序列,在VH44和VL100位各突变一个氨基酸为半胱氨酸,用linker连接形成scdsFv,人工合成此序列,克隆入表达载体pET22b(+),在大肠杆菌中表达目的蛋白,镍柱亲和层析法纯化,并进行SDS-PAGE、Westernblot鉴定。ELISA法和鼠脑组织抹片方法检测scdsFv对RV的特异结合活性;硫氰酸盐洗脱法测定scdsFv蛋白对RV的相对亲和力指数;分别用荧光抗体病毒中和试验(FAVN)和小鼠体内中和试验测定scdsFv的体外和体内中和活性。【结果】成功获得RV人源二硫键稳定单链抗体序列,大肠杆菌中表达得到scdsFv蛋白;分子量约为30.0kDa,Western blot表明此蛋白能与抗His单克隆抗体发生特异性反应。scdsFv能与RVVero疫苗特异结合,且结合力随抗原浓度降低而降低;scdsFv能与鼠脑组织中的RV结合。FAVN法测得scdsFv的中和效价为41IU/mL;小鼠体内中和试验表明scdsFv能保护55.6%鼠耐过强毒攻击。【结论】获得的scdsFv,具有良好的RV结合活性和体内外中和活性,有可能被用于暴露后狂犬病的预防。; 杨瑞梅杨松涛王承宇高玉伟单虎夏咸柱; 关键词：狂犬病毒 G蛋白中和活性

狂犬病病毒核酸RT-LAMP检测方法的建立被引量：11: 2011年; 目的建立RT-LAMP方法,实现对狂犬病病毒核酸的快速、灵敏、简便的检测。方法针对狂犬病病毒的核衣壳蛋白基因(N基因)和大转录酶蛋白基因(L基因)中的高度保守区段分别设计了一套引物,建立了检测狂犬病病毒的快速一步式反转录-环介导恒温扩增(RT-LAMP)方法。样品提取总RNA后,加入BstDNA聚合酶、各种反应成分,于63℃恒温水浴箱中放置60min,80℃5min终止反应,加入荧光染料SYBR GREEN I,根据颜色变化肉眼判定结果。结果两套引物对狂犬病病毒RNA进行RT-LAMP检测,均有良好的特异性,灵敏度均比RT-巢式PCR高10倍以上。结论该方法简单、快速,不需电泳,利用染色剂肉眼判定结果,不需要大型仪器,能在70min内完成对狂犬病病毒RNA的检测,适用于可疑动物的快速检测,尤其适合基层使用。; 黄元向华陈晶向蓉张健騑宣华; 关键词：狂犬病病毒 RT-LAMP

狂犬病病毒Vero ERA株G蛋白333位点精氨酸突变株的构建: 2009年; 狂犬病病毒糖蛋白(G)在病毒的致病性中起着主要作用,其第333位点精氨酸(Arg)是决定病毒神经细胞侵嗜性的重要分子基础之一。为研制更加安全有效的狂犬病减毒活疫苗,本试验采用负链RNA病毒反向遗传学方法,在体外将狂犬病病毒Vero细胞适应株ERA糖蛋白G333位点精氨酸突变为谷氨酸,构建减毒株ERAGΔ,减弱了其潜在的毒力返强的危险。救获的ERAGΔ突变株在Vero细胞上表现出与ERA株亲本病毒相似的生长动力学特性。本研究成功构建并拯救出了狂犬病病毒ERA减毒疫苗株,为研制开发狂犬病病毒无毒疫苗提供了候选株。; 郭利王喜军冯娜葛金英杨松涛夏咸柱步志高; 关键词：狂犬病病毒反向遗传操作

动物狂犬病病毒巢式RT-PCR检测方法的建立被引量：11: 2009年; 以GenBank收录的多基因型狂犬病病毒(RV)N基因序列为参考,设计了简并的PCR引物,建立了能够有效扩增7种基因型RV基因组片段的巢式RT-PCR(nested RT-PCR)方法,命名为RVN371。该方法能够检测到4.6个TCID50的SRV9固定毒,对犬、猪、蝙蝠及牛的狂犬病阳性脑组织样品均表现出良好的特感性:扩增产物目的带位置正确,未见非特异性扩增条带。对比试验表明,RVN371对街毒脑组织样品检测的灵敏度较乳鼠脑内接种试验(MIT)高出100倍;在对3种鼠脑固定毒、12种犬脑街毒样品的检测中,与RV检测的金标方法——免疫荧光试验(FAT)完全符合。RVN371为动物狂犬病的实验室诊断和流行病学研究提供了有利的工具。; 江禹王莉莉韩小虎邵明富范金红刘芳涂长春; 关键词：狂犬病病毒巢式RT-PCR

狂犬病毒荧光定量PCR标准品的制备与应用: 目的构建用于检测狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)的荧光定量 PCR 标准品及制作标准曲线,为建立准确检测狂犬病病毒荧光定量 PCR 方法奠定基础。方法:根据 GenBank 发表的狂犬病病毒 N 基因序列和保...; 郑学星王化磊侯小强孙培录夏咸柱; 文献传递

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