安徽省“十一五”科技攻关项目(07010302144)
- 作品数：8 被引量：35H指数：4
- 相关作者：李郁魏建忠孙裴王桂军陈申秒更多>>
- 相关机构：安徽农业大学西北农林科技大学安徽省动物疫病预防与控制中心更多>>
- 发文基金：安徽省“十一五”科技攻关项目国家科技支撑计划长三角科技联合攻关项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立及应用被引量：9
- 2010年
- 在已建立的副猪嗜血杆菌(HPS)、多杀性巴氏杆菌(Pm)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)的单重PCR检测方法的基础上,通过对扩增条件的优化,利用一次PCR反应可同时扩增出APP的256 bp、Pm的457 bp、HPS的822 bp的特异性片段,建立了HPS、Pm、APP的多重PCR实验室诊断方法。该复合PCR可检测60 pg的HPS、120 pg的Pm、50 pg的APP。利用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性猪体内分离到的39株细菌,结果显示HPS、Pm、APP分别为12、16、2株,对39份病料的检测与常规细菌分离鉴定结果一致,可见该方法适用于HPS、APP、Pm的临床快速检测。
- 陈申秒李郁王金生李炳更魏建忠
- 关键词：副猪嗜血杆菌多杀性巴氏杆菌
- 副猪嗜血杆菌安徽分离株的致病性与RELP基因型的相关性研究被引量：7
- 2009年
- 为了研究PCR限制性酶切电泳长度多态性试验(PCR-RELP)与副猪嗜血杆菌(HPS)对豚鼠的致病性,本研究采用PCR-RELP分析12株HPS安徽分离株的tbpA基因,并将12株HPS分为5种不同的RELP基因型(AAA、BBB、BAB、BAC、CAB);12株HPS对豚鼠的致病性试验表明,致病性最强的RELP基因型为BAC,其次是AAA和CAB,无致病性的为BBB和BAB型。进一步分析12株HPS的tbpA基因序列系统进化关系发现,HPS的RFLP基因型的不同,其致病性存在差异,表明tbpA是影响HPS致病性的重要因素。
- 李郁陈申秒王桂军孙裴魏建忠
- 关键词：HPS
- 副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的分段表达及其免疫原性分析被引量：3
- 2011年
- 本研究旨在获得副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物(TbpA),并对其免疫原性进行分析鉴定。采用生物信息学方法预测HPS的TbpA抗原表位,根据GenBank上发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成3对引物,用PCR从安徽省HPS分离株(LJ3)tbpA中分段扩增出tbpA1、tbpA2和tbpA3,并连接到pET-32a(+)载体上,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE检测目的蛋白,Western blotting分析重组蛋白的免疫活性;通过小鼠免疫攻毒保护试验和血清杀菌力试验,鉴定重组蛋白的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力。结果表明,从HPS(LJ3)tbpA中扩增出与预期设计的1 140、897、666bp大小相符的3个片段(tbpA1、tbpA2、tbpA3),扩增产物连接载体得到重组质粒,在大肠杆菌中实现表达,获得大小为62、54、44ku的目的蛋白(rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3),均能与HPS阳性血清反应。rTbpA1与甲醛灭活菌体对小鼠免疫攻毒的保护率分别为20%和40%,但rTbpA1引起小鼠平均死亡时间显著延迟,兔抗rTbpA1与兔抗HPS(LJ3)血清具有同样显著的杀菌活性。结果显示,成功表达的rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3均具有良好的反应原性,其中rTbpA1更具有良好的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力,可望成为副猪嗜血杆菌病疫苗和血清学检测的候选成分。
- 辛伟李郁黄晓慧魏建忠
- 关键词：副猪嗜血杆菌
- PRRSV感染猪体内多杀性巴氏杆菌的分离与血清型鉴定被引量：4
- 2009年
- 应用常规方法和PCR技术,对来自安徽肥西、庐江、肥东、定远、桐城5个地区猪场检测为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性的肺脏进行多杀性巴氏杆菌(Pm)的分离及其血清型鉴定。结果显示,49份病料中分离鉴定出7株Pm,且均属于A型,分离率为14.3%,高于其他细菌(副猪嗜血杆菌、猪链球菌)的检出率。表明猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)患猪继发或混合感染Pm的比率较高,而且A型Pm是安徽省感染猪群中的主要血清型。
- 陈申秒李郁谢玉洁王桂军魏建忠
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征多杀性巴氏杆菌血清型
- 猪呼吸道疾病综合征4种病原菌复合PCR方法的建立及其初步应用被引量：6
- 2013年
- 目的建立检测猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)中肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)、猪链球菌(Streptococcus suis,SS)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)和猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)的四重PCR方法。方法根据GenBank中登录的Mhp的P36基因序列设计引物,同时参考文献分别合成SS、HPS和Pm的特异性引物,通过4因素(Taq酶、Mg2+、引物、dNTPs)4水平的L16(44)正交试验优化PCR反应体系,建立检测Mhp、SS、HPS和Pm的四重PCR方法,并进行特异性、敏感性及重复性验证。运用该方法及单一PCR方法,对PRDC猪的鼻腔拭子及肺脏组织样品进行检测,另对肺脏组织样品进行SS、HPS和Pm的常规分离鉴定。结果确立了四重PCR方法最适反应体系及反应条件;应用建立的四重PCR方法在568、294、821和457 bp处均可见与预期相符的特异性条带,8次重复扩增后的电泳结果一致,最低检测限量分别为560、260、280和200 pg,表明该方法特异性、敏感性及重复性较好;PRDC猪的鼻腔拭子及肺脏组织样品的四重PCR方法检测结果与单一PCR方法相比,差异无统计学意义(P>0.05),四重PCR及单一PCR方法的HPS的检出率则显著高于常规细菌分离鉴定(P<0.05)。结论所建立的四重PCR方法,可直接用于临床PRDC 4种病原菌的鉴定,为开展PRDC流行病学调查提供了有效的技术手段。
- 赵洪武李郁孙裴刘文赵东魏建忠
- 关键词：链球菌属多杀性巴氏杆菌聚合酶链反应
- 安徽PRSS发病猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其耐药性分析被引量：6
- 2009年
- 目的了解猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪继发感染副猪嗜血杆菌(HPS)的情况及分离菌株的药物感受性。方法应用细菌分离培养、形态学检查、生化试验和PCR技术,对2007年1月至2008年12月从安徽不同地区采集的146头份PRRS发病猪的病料进行HPS检测,并采用标准K-B纸片法对分离菌株进行14种抗菌药物敏感试验。结果分离鉴定出12株HPS,检出率为8.22%(12/146);12株HPS对氯霉素100%敏感,环丙沙星为91.7%,阿莫西林和新霉素为83.3%,对罗红霉素100%耐药,阿米卡星为83.3%。结论安徽省不同地区PRRS感染猪群中均存在程度不同的HPS感染,各地区HPS分离株表现出形态上的变化特征和一致的生化特性,且有对临床常用抗菌药物耐药性增强的趋势。
- 李郁陈申秒王桂军孙裴魏建忠
- 关键词：副猪嗜血杆菌猪繁殖与呼吸综合征继发感染耐药性
- 安徽PRSS发病猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其耐药性分析
- 应用细菌分离培养、形态学检查、生化试验和PCR技术,对2007年1月-2008年12月从安徽不同地区采集的146头份PRRS发病猪的病料进行HPS检测,并采用标准K-B纸片法对分离菌株进行14种抗菌药物敏感试验.分离鉴定...
- 李郁陈申秒王桂军孙裴魏建忠
- 关键词：副猪嗜血杆菌猪繁殖与呼吸综合征继发感染耐药性
- 文献传递
- 猪瘟病毒NS3蛋白对牛肾细胞生长的影响
- 2010年
- 猪瘟病毒蛋白NS3被认为与培养细胞发生病变存在紧密联系,为了进一步探讨NS3蛋白单独作用及其表达水平对培养细胞CPE发生的影响,本研究构建了2种携带NS3基因的真核表达载体,分别在牛源细胞MDBK中表达NS3蛋白,利用荧光显微镜观察宿主细胞形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western-blot检测目的蛋白表达情况。研究结果表明,2种载体均在MDBK中成功表达NS3蛋白;其中pCD-NA3.1-NS3质粒所表达的目的蛋白量较大,并使宿主细胞表现出明显的形态学变化;细胞凋亡检测结果表明NS3蛋白大量表达的宿主细胞凋亡率显著高于对照组。猪瘟NS3蛋白可以不需要猪瘟病毒其他蛋白的参与,具有直接造成宿主细胞发生病变的能力,但较低的蛋白存在水平并不能对宿主细胞造成可检测的损伤,推测活体内若能有效干扰瘟病毒NS3蛋白的产生或其功能可能会降低猪瘟或牛病毒性腹泻-黏膜病的发病率或使临床表现减轻。
- 孙裴张彦明魏建忠李郁王桂军
- 关键词：猪瘟病毒NS3蛋白
- 2种气管黏膜上皮细胞体外培养技术的研究被引量：2
- 2010年
- 目的为以猪气管黏膜上皮为细胞模型的研究奠定物质基础,进一步探讨猪气管黏膜上皮细胞的体外传统培养和气液界面培养技术,从而使2种培养技术优势互补。方法对猪气管上皮分离、纯化、培养和传代,并探索上皮细胞最佳冻存复苏条件;复苏后的气管上皮细胞进行气液界面培养,绘制细胞生长曲线和观察细胞纤毛生发情况。利用免疫组化法鉴定上皮细胞。结果4步纯化法可以得到高纯度的气管上皮细胞。使用胎牛血清、DMEM/F12培养液和DMSO的体积分数为50%、40%和10%的冻存体系保存的气管上皮,复苏后细胞存活率平均可达89%。优化后的传统方式培养的上皮细胞可连续传代到第8代,但从第2代开始便观察不到纤毛,转换成气液界面连续培养2代后重新生发纤毛,细胞存活期延长。免疫组化结果显示分离培养细胞为上皮细胞。结论成功建立了2种猪气管上皮细胞培养技术,并找到适宜的气管上皮细胞冻存条件,节省了不断原代取材的成本和时间,并成功实现传统培养细胞冻存复苏后很快适应气液界面的培养并恢复细胞的天然结构,为猪气管黏膜上皮相关研究提供丰富的细胞来源。
- 孙裴张彦明魏建忠李郁王桂军何长生王非
- 关键词：上皮细胞
