江西省自然科学基金(0340070)
- 作品数：4 被引量：5H指数：1
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- 相关机构：江西省医学科学研究所南昌大学江西省医学生物高技术重点实验室更多>>
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- 重组小鼠干细胞逆转录病毒载体高效基因转染CD41^+、UT7、U937和MDA-MB-435细胞被引量：5
- 2004年
- 目的 :研究重组小鼠干细胞逆转录病毒载体介导基因转染 ,探索一条高效基因转染的途径 ,为重组小鼠干细胞逆转录病毒载体在基因转染中的应用提供理论依据和奠定实验基础。方法 :①逆转录病毒载体的构建 :EC1- 4 (repeats 1- 4ofcadherin - 5extracellulardomains)基因克隆产物和mutant(Ser2 2 2A)MEK 1基因克隆产物 ,Bg1Ⅱ和EcoRⅠ限制性内切核酸酶切割后 ,克隆进入逆转录病毒表达载体pMSCV。②CD4 1+ 细胞的获取和细胞培养 :从脐带血分离的CD34+ 细胞通过TPO诱导表达CD4 1,FACS分离CD4 1+ 细胞。高糖DMEM培养液培养NIH 3T3和MDA -MB - 4 35细胞 ,U937细胞培养在RPMI- 16 4 0培养液 ,UT7细胞是细胞因子依赖性细胞株 ,Iscove’smodifiedDulbeco’s培养液中加入GM -CSF。③测定病毒滴度 :逆转录病毒载体转入包装细胞 2 93,36h后收集病毒上清液 ,感染NIH3T3细胞 ,流式细胞仪测定病毒滴度。④Westernblot:基因转染CD4 1+ 、UT7、U937和MDA -MB - 4 35细胞 ,Westernblot检测基因产物的表达。结果 :2 93细胞产生高滴度MEK1pMSCV病毒 :3 1× 10 7,高滴度EC1- 4pMSCV病毒 :1 0×10 8。用稀释 8倍的病毒转染基因 ,重组逆转录病毒MEK1pMSCV转染白血病细胞株UT7和U973,GFP阳性细胞 (转染阳性细胞 )分别是 6 0 73%、
- 石小玉李文林梁朝张际青赵林李红
- 关键词：基因转染U937细胞
- 黏附素5胞外区克隆、转染及抗人乳腺癌细胞生长的研究
- 2007年
- 目的:克隆和转染黏附素5胞外区,并研究其对人乳腺癌MDA-MB435细胞株生长的影响。方法:RT-PCR技术克隆黏附素5胞外区(称为CED1-4),将其插入pMSCV质粒载体,在大肠杆菌XL-blue扩增,提取和纯化pMSCV-CED1-4,酶切、电泳和测序检测CED1-4序列。CED1-4基因转染MDA-MB435细胞株,RT-PCR和Western blotting检测MDA-MB435细胞表达CED1-4。细胞增殖实验和乳腺癌裸小鼠致瘤实验检测CED1-4对MDA-MB435细胞体内外生长的影响。结果:构建了重组体pMSCV-CED1-4,电泳显示CED1-4条带在1636bp-1018bp区间,测序显示CED1-4基因长1452bp,编码484氨基酸。经PCR和Western blotting证实,CED1-4基因转染的MDA-MB435细胞在mRNA和蛋白质水平表达CED1-4。细胞增殖实验结果表明,实验组MDA-MB435细胞增殖低于实验对照组和空白对照组(P<0.05)。乳腺癌裸小鼠致瘤实验显示,实验组移植瘤平均体积和重量低于实验对照组和空白对照组(P<0.05)。结论:黏附素5胞外区CED1-4能在体内外抑制人乳腺癌MDA-MB435细胞株的生长。
- 石小玉李文林熊丽霞张际青熊建军李红
- 关键词：钙粘着糖蛋白类克隆基因转染
- 促分裂原活化蛋白激酶信号阻断剂在TPO促进UT7细胞增殖和分化中的作用
- 2005年
- 目的探索促分裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)信号阻断剂对巨核细胞生长分化因子(TPO)促进UT7细胞增殖和分化作用,阐明TPO对UT7细胞作用的机制。方法将EGFPpMSCV和MEK1pMSCV质粒转染UT7细胞;转染细胞与TPO共培养,Westernblot法检测UT7细胞MEK1(MAPK/Erkkinase1)磷酸化;观察转染突变(Ser222A)的MEK1和MAPK阻断剂PD98059对UT7细胞增殖的影响;采用流式细胞仪检测转染突变(Ser222A)的MEK1和MAPK阻断剂PD98059对UT7细胞表达CD41的影响。结果①重组逆转录病毒载体MEK1pMSCV和EGFPpMSCV转染UT7细胞,EGFP阳性率为60.73%。②TPO不同的作用时间(1h,3h),实验组磷酸化MEK1均低于对照组(P值均<0.05)。③MAPK阻断剂PD98059和外源突变MEK基因阻断了TPO对UT7细胞的增殖作用,DMSO对照组的细胞增殖率为98.58%,PD98059组的细胞增殖率为39.00%(P<0.05);转染EGFPpMSCV组细胞增殖率为102.12%,转染MEK1pMSCV组细胞增殖率为48.93%(P<0.05)。④MAPK阻断剂PD98059组UT7细胞CD41表达(10.27%)明显低于对照组(36.43%),转染MEK1pMSCV组UT7细胞CD41表达(24.03%)明显低于转染EGFPpMSCV组(40.16%)。结论TPO诱导UT7细胞MEK1磷酸化,TPO作用时间与UT7细胞MEK1的磷酸化有明显的关系。
- 李文林石小玉李蓉唐洪林
- 关键词：TPO细胞增殖分化细胞培养基因转染质粒构建
- 人可溶性粘附素5截短体的克隆、表达及生物活性测定
- 2008年
- 目的:克隆和转染人可溶性粘附素5截短体(sCadherin5△),并检测其生物活性。方法:RT-PCR扩增Cadher-in5△cDNA,并克隆入pMSCV逆转录病毒载体,构建pMSCV/sCadherin5△,转化感受态大肠杆菌XL-blue菌株,提取、纯化和酶切质粒,测序分析sCadherin5△,转染NIH3T3细胞,mRNA和蛋白质水平检测NIH3T3细胞表达和分泌sCadherin5△,MTT方法检测sCadherin5△生物活性。结果:PCR产物约为1128bp,构建了pMSCV/sCadherin5△质粒载体,序列测定的结果与GeneBank中Cadherin5胞膜外区121bp至1248bp之间的序列一致。pMSCV/sCadherin5△转染的NIH3T3细胞表达和分泌sCadherin5△,sCadherin5△抑制HUVEC细胞体外增殖。结论:克隆、表达和分泌了具有生物活性的人sCadherin5△。
- 李文林石小玉熊丽霞王志刚周莹李红
- 关键词：克隆逆转录病毒载体NIH3T3细胞
