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国家自然科学基金(81171758): 作品数：11 被引量：14H指数：3; 相关作者：陈伯华胡有谷马学晓岳斌杨堃更多>>; 相关机构：青岛大学青岛大学医学院附属医院即墨市人民医院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

Survivin、TGFβ3与TIMP-1慢病毒载体的构建及其人髄核细胞表达被引量：1: 2014年; 目的构建人生存素（Survivin）、转化生长因子03（TGFtβ3）与基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）三基因过表达慢病毒载体，通过一次转染，实现Survivin、TGFβ3、TIMP-1三基因在人退变椎间盘髓核细胞的稳定转染，为逆转或延缓椎间盘退变的基因治疗提供实验基础。方法应用Survivin、TGFβ3、TIMP-1慢病毒载体联合转染人退变髓核细胞，应用Real—TimePCR技术检测转染后基因表达情况。结果人退变椎间盘髓核细胞在转染后1周，Survivin、TGFβ3、TIMP-1三基因在基因水平均获得稳定过表达，并且其表达能维持细胞传至第3代或更久。Real—TimePCR检测结果显示，目的病毒组Survivin、TGFβ3、TIMP-1均过表达，其相对表达量与空白组比较，差异有显著性（F=12．96～3889．70，P〈O．05）。结论Survivin、TGFβ3与TIMP-1慢病毒载体能够稳定转染人退变椎间盘髓核细胞，并且能长时间维持其表达，从而发挥生物学效应。; 郭柱岳斌马学晓胡有谷杨堃陈伯华; 关键词：凋亡抑制蛋白质类转化生长因子Β3 金属蛋白酶1组织抑制剂慢病毒属退变

慢病毒GV115-AIF siRNA重组表达系统的构建及鉴定: 2016年; 目的:构建高效的慢病毒GV115-AIF si RNA重组表达系统。方法:根据目的基因AIF以及RNA干扰序列设计原则,利用设计软件设计了3个可能的AIF si RNA序列。应用全基因合成技术和亚克隆技术构建GV115-AIF si RNA重组质粒,并采用聚合酶链反应技术(PCR技术)和基因测序技术对GV115-AIF si RNA重组质粒鉴定。利用GV115病毒包装辅助p Helper 1.0质粒和p Helper 2.0质粒进行病毒包装。病毒包装后转染人胚肾293T细胞,通过应用逆转录定量PCR技术(RT-PCR技术)检测转染后对人胚肾293T细胞中AIF基因的敲减效率,筛选最高效的AIF si RNA基因序列。结果:GV115-AIF si RNA质粒PCR鉴定显示位于341bp附近的条带。测序结果与设计的基因序列完全吻合。3个可能的AIF si RNA序列中基因敲减效率最高的可达到88.3%。结论:成功构建高效的慢病毒GV115-AIF si RNA重组表达系统。; 赛佳明马学晓邱晨生陈伯华胡有谷; 关键词：慢病毒 RNA干扰基因治疗

Survivin、TGFβ3和TIMP1基因重组慢病毒多表达载体构建及其表达活性检测被引量：1: 2015年; 目的应用Gateway技术构建生存素(Survivin)、人转化生长因子β3(TGFβ3)和基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)慢病毒多表达质粒,并检测其表达活性。方法应用Gateway技术,以自剪切多肽2A串联Survivin、TGFβ3、TIMP1的3段外源基因,并克隆到慢病毒多表达质粒上,通过RT-PCR和Western-blot技术分别检测质粒转染293T细胞后目的基因mRNA和蛋白质表达水平。结果 RT-PCR和Western-blot检测结果显示,慢病毒多表达质粒成功表达了3种目的基因,且其mRNA和蛋白质表达水平较空载体对照组、PBS对照组明显升高,差异有显著性(F=17.87~69.11,q=6.94~15.47,P<0.05)。结论成功构建了慢病毒多表达质粒pLenti6.3-Survivin-P2A-TGFβ3-T2A-TIMP1,为下一步病毒的制备以及体内实验提供了基础。; 彭文彬杨堃马学晓岳斌胡有谷陈伯华; 关键词：生存素转化生长因子Β3 基质金属蛋白酶抑制剂1 慢病毒属

慢病毒GV115-caspase-3 siRNA重组表达系统的构建及鉴定: 2015年; 目的构建高效的慢病毒GV115-caspase-3 siRNA重组表达系统。方法根据RNA干扰序列设计原则,设计4个可能的caspase-3 siRNA序列。应用全基因合成技术和亚克隆技术构建GV115-caspase-3 siRNA并采用PCR和测序对其鉴定。病毒包装后转染人胚肾293T细胞,通过应用RT-PCR技术检测转染后caspase-3基因敲减效率,筛选高效的GV115-caspase-3 siRNA。结果 GV115-caspase-3 siRNA质粒PCR鉴定显示位于341bp附近的条带,测序结果与设计的基因序列完全吻合,4个可能的caspase-3 siRNA序列中基因敲减效率最高的可达到84.2%。结论成功构建高效的慢病毒GV115-caspase-3 siRNA重组表达系统。; 赛佳明马学晓邱晨生陈伯华胡有谷; 关键词：慢病毒 CASPASE-3 RNA干扰基因治疗

慢病毒介导TGFβ3和TIMP1体外联合感染对人退变椎间盘髓核细胞的影响被引量：2: 2015年; 目的探讨慢病毒载体介导的转化生长因子β3（TGFβ3）和基质金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）联合感染对人退变椎间盘髓核细胞的影响。方法应用构建的TGFβ3-P2A-TIMP1慢病毒载体感染人髓核细胞,通过实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）技术、Western blot技术检测其对人髓核细胞代谢的影响。结果Real-time qPCR检测结果显示,目的基因感染组的TGFβ3、TIMP1、Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达量均明显高于其他各组（F=16.350~74.378,q=2.010~10.620,P〈0.05）。Western blot检测结果显示,目的基因感染组Ⅱ型胶原、蛋白多糖的蛋白表达量均明显高于对照组（F=50.495~66.110,q=8.061~16.624,P〈0.05）。结论慢病毒载体介导的TGFβ3和TIMP1双基因联合感染人髓核细胞可促进Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成,改善髓核细胞外基质代谢。; 邱晨生沈娜娜岳斌相宏飞杨堃胡有谷陈伯华; 关键词：转化生长因子Β3 基质金属蛋白酶抑制剂1 慢病毒属

慢病毒载体GV115介导Caspase-3 siRNA转染人椎间盘髓核细胞的生物学效应被引量：2: 2015年; 目的：研究慢病毒载体GV115介导Caspase-3 si RNA转染人椎间盘髓核细胞的生物学效应。方法：采集12例外伤致脊柱爆裂性骨折患者（22~36岁）术中切除的椎间盘髓核组织,采用组织块法分离培养髓核细胞并传代。取第2代髓核细胞,分为GV115-Caspase3 si RNA组、GV115组和对照组,各组12个细胞培养孔。在荧光显微镜下观察计数阳性髓核细胞,计算GV115-Caspase3 siRNA对人椎间盘髓核细胞的转染效率;采用免疫荧光法检测三组髓核细胞中Caspase-3表达;采用MTT法检测三组髓核细胞活性;采用Western-Blot法和Antonopulos法分别检测三组髓核细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量。结果：椎间盘髓核细胞被成功分离培养,培养1周后细胞达到80%融合,进行传代培养。转染后1周（85.6±1.3）%的髓核细胞可被GV115-Caspase3 si RNA转染而表达绿色荧光素。GV115-Caspase3 siRNA组Caspase-3免疫荧光阳性细胞率[（19.4±3.2）%]较GV115组[（84.3±9.2）%]和对照组[（83.9±8.7）%]明显减少（P〈0.05）,OD值（1.56±0.21）较GV115组（0.91±0.15）和对照组（0.92±0.17）高（P〈0.05）,Ⅱ型胶原免疫印迹染色强度（1.32±0.09）较GV115组（0.81±0.05）和对照组（0.79±0.04）高（P〈0.05）,蛋白多糖含量（0.56±0.09）较GV115组（0.35±0.06）和对照组（0.34±0.05）高（P〈0.05）。结论：GV115-Caspase3 siRNA可高效转染人椎间盘髓核细胞,增强髓核细胞的生物活性,并促进细胞外基质的合成。; 赛佳明马学晓邱晨生陈伯华胡有谷; 关键词：髓核细胞慢病毒 CASPASE-3

慢病毒介导TGF-β3、CTGF和TIMP1联合转染对兔退变椎间盘影响被引量：3: 2013年; 目的研究慢病毒介导的转化生长因子β3(TGF-β3)、结缔组织生长因子(CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制因子l(TIMP1)联合转染对兔退变椎间盘的影响。方法新西兰大白兔15只,纤维环穿刺法建立椎间盘退变模型,实验组注入携带TGF-β3、CTGF和TIMP1基因的慢病毒颗粒50μL,对照组注入等量空病毒,各组在相同条件下独立培养,分别于术后16、20周对退变椎间盘进行影像学观察。结果实验组与对照组及穿刺组相比,椎间盘退变程度明显减轻,差异有显著性(χ2=9.11、19.05,P<0.05)。结论 TGF-β3、CTGF和TIMPI多基因联合转染后可以起到延缓椎间盘退变的作用。; 于涛刘勇陈伯华徐海燕姚如永; 关键词：慢病毒属椎间盘退变

慢病毒介导生存素基因转染反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞生物学效应的比较被引量：1: 2015年; 目的研究慢病毒介导生存素基因(Lentivirus-Survivin)对早、晚期反分化人椎间盘髓核细胞的生物学效应。方法应用组织块法分离培养人椎间盘髓核细胞,采用绿色荧光素标记法检测慢病毒载体对其转染效率。通过免疫荧光法、MTT法、Western-Blot法和Antonopulos法检测比较Lentivirus-Survivin对反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞Survivin表达、细胞活性、II型胶原和蛋白多糖合成的影响。结果反分化早期髓核细胞中存在Survivin的表达,而反分化晚期髓核细胞中则极少表达。Lentivirus-Survivin可高效转染反分化早期和晚期椎间盘髓核细胞,并促进细胞中Survivin表达。对于反分化早期椎间盘髓核细胞,Lentivirus-Survivin可增强髓核细胞活性以及细胞外基质(II型胶原和蛋白多糖)的合成;对于反分化晚期髓核细胞,其反而抑制细胞活性以及细胞外基质的合成。结论 Lentivirus-Survivin适用于反分化早期椎间盘髓核细胞,而不适用于反分化晚期的髓核细胞。; 赛佳明马学晓邱晨生陈伯华胡有谷; 关键词：慢病毒生存素椎间盘髓核细胞

Survivin在胎儿椎间盘组织中的表达及意义被引量：3: 2013年; 目的探讨Survivin蛋白在胎儿椎间盘组织中的表达及意义。方法应用免疫组织化学技术检测3例胎儿11个椎间盘组织中Survivin蛋白的表达。结果胎龄为20、26、28周胎儿椎间盘组织中Survivin阳性细胞百分率分别为(4.79±3.44)%、(3.98±3.72)%和(3.12±1.56)%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Sur-vivin在胎儿椎间盘中表达,可能对胎儿椎间盘的发育起重要作用。; 杨克石岳斌马学晓相宏飞胡有谷陈伯华; 关键词：凋亡抑制蛋白质类胎儿椎间盘

人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒的构建及活性检测被引量：4: 2012年; 背景:前期试验显示单个病毒载体介导的多基因共表达系统能够显著提高椎间盘退变转基因疗效。目的:构建人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因重组慢病毒多表达质粒。方法:应用全基因合成技术,以"自剪切多肽2A"串联目的基因,并克隆到慢病毒表达质粒构建重组慢病毒质粒Lenti-TGF-β3-P2A-CTGF-T2A-TIMP1。转染293细胞后,应用RT-PCR和Western-Blot技术分别检测转染后不同时间点目的基因mRNA和蛋白质表达水平。结果与结论:RT-PCR和Western-blot技术检测结果显示重组质粒成功表达了3种目的基因,并于转染后48h左右达到峰值,"2A"结构下游基因蛋白质表达量约为上游基因的80%。说明成功构建了携带人转化生长因子β3、结缔组织生长因子和基质金属蛋白酶抑制剂1基因的慢病毒多表达质粒。; 江峰岳斌马学晓张国庆胡有谷陈伯华; 关键词：转化生长因子Β3 结缔组织生长因子基质金属蛋白酶抑制剂1 慢病毒 293细胞

国家自然科学基金(81171758)

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