河北省自然科学基金(C2006000796)
- 作品数：7 被引量：11H指数：2
- 相关作者：王洁李荷香顾洪涛王旭石宏更多>>
- 相关机构：河北医科大学河北医科大学第二医院更多>>
- 发文基金：河北省自然科学基金河北省卫生厅医学科学研究重点课题更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 复发性涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤模型的建立及其生物学特性被引量：2
- 2008年
- 目的建立人复发性涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤动物模型。方法将人复发性涎腺腺样囊性癌组织块,进行裸鼠皮下接种、传代,建立裸鼠移植瘤模型,并对其进行光镜、电镜、免疫组织化学及染色体分析。结果人复发性腺样囊性癌组织块移植于裸鼠后,获原代移植成功。2年期间移植瘤在裸鼠之间共连续传代4代,移植BALB/C裸鼠5只,平均潜伏期44.33天。经光镜、电镜、免疫组织化学观察发现移植瘤与其原发肿瘤结构特征一致。染色体检查为亚中着丝点染色体,符合人类体细胞核型。结论成功建立人复发性涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤模型并传代,移植瘤保留了原发肿瘤的组织学特征和染色体核型。
- 侯亚丽王洁张昊王旭李荷香顾洪涛
- 关键词：腺样囊性癌涎腺裸鼠复发
- 靶向抑制人木糖基转移酶-I基因的shRNA真核表达载体的构建被引量：3
- 2008年
- 目的构建靶向抑制人木糖基转移酶-Ⅰ(XT-Ⅰ)基因的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,为探讨唾液腺肿瘤性肌上皮细胞合成及分泌蛋白多糖(PG)的研究奠定基础。方法根据GenBank提供的XT-Ⅰ基因序列,设计短链寡核苷酸,化学合成后经退火形成双链DNA片段,克隆到Pgenesil-1载体中,构建shRNA真核表达载体WJ1-WJ6,行酶切及核酸测序鉴定;将构建的XT-Ⅰ特异性shRNA表达载体转染体外培养的人唾液腺腺样囊性癌细胞株ACC-M,在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,流式细胞术检测转染效率,并采用半定量RT-PCR和Western blot分别检测转染后细胞XT-Ⅰ基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经酶切、连接后构建的6个质粒命名为WJ1、WJ2、WJ3、WJ4、WJ5、WJ6。酶切及核酸测序鉴定证实,构建的shRNA表达载体WJ1-WJ6序列正确;转染WJ1-WJ6后ACC-M细胞均可表达绿色荧光;流式细胞术测定转染效率平均为50.26%;RT-PCR结果显示,WJ3显著抑制XT-Ⅰ mRNA的表达,抑制率为72.39%;Western blot结果显示,WJ3有效抑制XT-Ⅰ的蛋白表达,抑制率为70.18%。结论成功构建靶向抑制XT-Ⅰ的shRNA真核表达载体WJ1-WJ6,其中WJ3可高效抑制XT-Ⅰ基因mRNA及蛋白水平的表达,为唾液腺肿瘤中PG的RNAi研究奠定了基础。
- 石宏王洁王旭顾洪涛侯亚丽于利洁
- 关键词：唾液腺肿瘤肌上皮细胞蛋白多糖
- 短发夹状RNA沉默H-ras基因对人涎腺腺样囊性癌细胞增殖的影响被引量：2
- 2008年
- 目的探讨H—ras基因对涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）生物学特性的影响以及作为SACC基因治疗靶点的可行性。方法构建H—ras靶向H-ras—shRNA质粒及阴性对照HK-shRNA质粒，经脂质体介导转染SACC—M细胞，G418筛选建立稳定转染细胞株，将细胞分为H—ras-shRNA转染组、HK—shRNA转染组及未转染细胞组。绘制细胞生长曲线检测细胞体外增殖能力；反转录聚合酶链法分析各组细胞中H—ras基因mRNA表达变化；荧光蛋白定量分析H—ras蛋白表达水平；流式细胞术测定细胞周期及细胞凋亡情况；裸鼠成瘤实验检测细胞在体内的成瘤能力，分析H—ras沉默对细胞增殖及凋亡的影响。结果成功构建重组质粒并导入SACC—M细胞，建立稳定表达质粒的细胞株。H—ras—shRNA质粒能有效降低SACC—M细胞中H—ras表达，H—ras基因抑制率为61．80％，H—ras蛋白表达抑制率为62．76％。细胞增殖活性明显受抑，G0G1期比例增加；流式细胞术结果显示实验组细胞凋亡率为30．82％，显著高于阴性对照组及空白对照组的4．29％和4．16％。H—ras沉默细胞的裸鼠体内成瘤能力降低。结论H—ras靶向shRNA干扰质粒能持续有效的抑制SACC—M细胞中H—ras基因及蛋白水平的表达，降低细胞体内外的增殖活性，并能有效诱导细胞凋亡。
- 于利洁王洁董福生石宏李荷香顾洪涛
- 沉默H-ras基因对人涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤的抑制作用被引量：1
- 2008年
- 目的:构建H-ras靶向短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)质粒,研究其对人涎腺腺样囊性癌裸鼠成瘤的抑制作用及其对移植瘤细胞增殖活性及细胞凋亡率的影响。方法:构建含H-ras靶向特定序列的真核表达质粒pHRAS,稳定表达pHRAS质粒的细胞为实验组,未处理的SACC-M细胞为对照组,建立裸鼠荷瘤模型,计算成瘤率;移植瘤原代培养检测质粒表达及瘤细胞增殖活性;免疫组织化学法检测瘤内H-ras蛋白表达;采用组织学观察、流式细胞术及TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况。结果:pHRAS质粒转染组成瘤率及肿瘤体积显著低于对照组,原代培养可见大量瘤细胞表达绿色荧光。实验组瘤内H-ras蛋白表达量明显减少,实验组肿瘤细胞凋亡率为(41.55±4.25)%,明显高于对照组的(4.73±1.35)%(P<0.05)。结论:shRNA沉默H-ras基因能抑制SACC-M细胞裸鼠皮下移植瘤的形成,在体内有效下调H-ras蛋白的表达,且对肿瘤细胞具有促凋亡作用。
- 于利洁王洁董福生孔世奇尹风任冀建文
- 关键词：涎腺肿瘤基因沉默
- 蛋白多糖与涎腺腺样囊性癌增殖的关系被引量：2
- 2010年
- 目的探讨蛋白多糖（proteoglycans）合成的阻抑对人涎腺腺样囊性癌ACC—M细胞增殖的影响。方法构建靶向人木糖基转移酶-Ⅰ（xylosyltransferase—Ⅰ，XT-Ⅰ）基因的短发卡状RNA（shorthairpin RNA，shRNA）真核表达载体shRNA—WJ3，转染人涎腺腺样囊性癌高转移株ACC．M细胞，通过G418筛选稳定转染的细胞，采用实时定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法测定shRNA-WJ3的基因沉默效果；检测各组细胞蛋白多糖合成分泌水平的变化。采用甲基噻唑基四唑法（MTT）检测细胞增殖情况；流式细胞术测定细胞周期改变。结果shRNA—WJ3转染ACC-M细胞后，细胞中XT—I基因的mRNA和蛋白表达抑制率分别为83．70％和79．60％；稳定转染shRNA—WJ3的ACC—M—WJ3细胞蛋白多糖分泌显著降低（P〈0．01），抑制率为49．71％～54．59％。MTT法检测结果表明：蛋白多糖合成阻抑后，ACC—M细胞增殖活性明显降低；ACC—M-WJ3细胞与对照组细胞相比：S期细胞数目减少；G1～G0期细胞数目增加，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论蛋白多糖合成分泌的阻抑能有效抑制ACC—M细胞的增殖。
- 石宏王洁董福生王旭李荷香
- 关键词：涎腺蛋白多糖
- 腺病毒介导HSV-TK/GCV与IL-2基因对人涎腺腺样囊性癌的抑制作用被引量：1
- 2010年
- 目的探讨腺病毒介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir,HSV-TK/GCV)与白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)基因联合应用对涎腺腺样囊性癌的抑制和杀伤作用。方法将0.2 ml细胞浓度为2×107/ml的涎腺腺样囊性癌高转移细胞株(salivary adenoid cystic carcinoma cell line withhigh tendency of lung metastasis,ACC-M)的细胞悬液接种于20只裸鼠皮下,建立涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤模型。随机将20只荷瘤裸鼠分为A组:HSV-TK/GCV和IL-2联合基因治疗组(TK(IL-2组);B组:HSV-TK/GCV组(TK组);C组:空病毒组(EGFP组);D组:ACC-M组;每组5只。分别于瘤体内注射TK(IL-2;TK;EGFP和无菌生理盐水。注射48小时后,对A、B、C组裸鼠每日腹腔注射GCV,D组每日腹腔注射生理盐水,连续10天。最后一次给药后第二天处死裸鼠,观察各组裸鼠的肿瘤体积和瘤重的变化,计算肿瘤生长抑制率;对移植瘤进行组织病理学观察;应用流式细胞仪检测移植瘤的细胞凋亡情况。结果在A组和B组中,ACC-M的生长均受到显著抑制。治疗后体积数减少,与ACC-M组比较差别有极显著性(P<0.01)。A组和B组抑瘤率分别为91%和76%;光镜下观察A组和B组均出现了明显的细胞凋亡;流式细胞仪检测A组和B组有明显的凋亡峰出现,凋亡率分别为30.55±0.23和13.53±0.32;C组凋亡率为10.07±0.31,D组凋亡率为8.34±0.41%。除C、D组之间差别无明显性外,其余各组之间差别均有极显著性(P<0.01)。A组和B组的细胞S期比例明显增加,G2/M期比例明显降低。结论 HSV-TK/GCV联合IL-2基因对ACC-M移植瘤有明显抑制作用,抑瘤效果优于单独应用HSV-TK/GCV系统。
- 侯亚丽王洁田燕李荷香
- 关键词：HSV-TK/GCVIL-2裸鼠涎腺
- 抗人木糖基转移酶蛋白多克隆抗体的制备及鉴定
- 2007年
- 目的:制备兔抗人木糖基转移酶(XT-I)蛋白的多克隆抗体,并对其特异性进行鉴定。方法:应用DNAssist软件分析XT-I蛋白的抗原表位,从中选择优势抗原表位,通过引物优化设计,PCR拼接并扩增相应区域DNA片段,将其插入原核表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌ER2566,获得融合表达产物。将纯化的可溶性蛋白GST-XT作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备抗XT-I蛋白的多克隆抗体,ELISA间接法测定效价。GST柱亲和层析法纯化抗体,采用Westernblot法鉴定该抗体的特异性和生物学活性。结果:确定XT-I的N端氨基酸序列QKHQPELAKKPPSRQKELLKRKLEQQEKGKG(175-205)为抗原表位,成功构建了重组表达载体,表达融合蛋白GST-XT,并以其为抗原,免疫新西兰大白兔,制备了抗XT-I蛋白的多克隆抗体。ELISA证实其效价高达1:640000;Westernblot结果显示:该抗体可与人涎腺腺样囊性癌肺转移细胞株ACC-M中表达的XT-I蛋白特异性结合。结论:获得具有高特异性的兔抗人XT-I蛋白多克隆抗体,为涎腺肿瘤性肌上皮细胞蛋白多糖生物合成的研究提供了特异性抗体。
- 石宏王洁董福生于利洁王旭顾洪涛
- 关键词：抗体抗原表位
