广西大学科研基金(XBZ120572)
- 作品数：4 被引量：10H指数：2
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- 不同逆转录载体系统应用于水牛胎儿成纤维细胞转基因的探索被引量：7
- 2013年
- 采用2种不同的逆转录病毒载体系统(pMX和pMSCV),构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组载体,探索能高效感染水牛胎儿成纤维细胞(BFFs)的病毒系统和感染方法.结果发现,2种逆转录病毒系统包装出的重组病毒滴度都能达到106,将pMX病毒系统生产的重组病毒经超速离心浓缩后,滴度可达到107;2种重组病毒都能感染BFFs,但pMX系统比pMSCV系统更能有效地感染BFFs;通过对病毒的感染方式进行比较,发现使用新鲜病毒连续感染BFFs 2次(每次间隔12 h),或者经过超速离心浓缩后的病毒感染BFFs 1次,可以显著提高感染效率.
- 邓彦飞刘真真李云芳刘庆友罗婵杨素芳石德顺
- 关键词：逆转录病毒载体转基因水牛胎儿成纤维细胞
- 水牛Oct4、Nanog基因的克隆及其在水牛胎儿成纤维细胞中的表达
- 2014年
- 【目的】转录因子Oct4、Nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子,在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和Nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体,并在水牛体细胞中表达,为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用,以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细胞系(iPSC)奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA和DNA,将RNA反转录成第1链cDNA,参照牛基因序列(Oct4:NM_174580,Nanog:NM_001025344)设计特异性引物,采用RT-PCR和PCR分别扩增Oct4和Nanog的编码区序列(the coding sequences,CDS)和DNA全长序列,其中Oct4全长DNA分3段扩增,Nanog全长DNA分2段扩增;利用生物在线分析软件对水牛Oct4和Nanog进行蛋白质结构预测和同源性比对;采用EcoRⅠ、XholⅠ和XholⅠ、NotⅠ双酶切,T4连接酶,将Oct4和Nanog的CDS连接到逆转录病毒载体pMX上,构建逆转录表达载体pMX-Oct4和pMX-Nanog;采用组织块法培养水牛胎儿成纤维细胞(buffalo fetal fibroblasts,BFFs),逆转录表达系统经过病毒包装后产生的病毒上清液感染BFFs,感染12—15h后,继续培养48 h;通过RT-PCR和免疫荧光技术检测转基因在BFFs中的表达情况。【结果】Oct4 CDS全长1 083 bp,编码361个氨基酸,DNA全长4 509 bp,包括5个外显子和4个内含子;Nanog CDS全长903 bp,编码301个氨基酸,DNA全长4 473 bp,包括4个外显子和3个内含子;将Oct4和Nanog基因序列提交到GenBank,分配的基因登录号分别为JN991003和JN991004;Oct4氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为98%、96%、91%和81%,Nanog氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为90%、81%、69%和47%;Oct4和Nanog蛋白结构与小鼠相应蛋白的结构相似,分别含有本家族特有的POU结构域和HOX同源结构域;成功构建表达Oct4和Nanog的逆转录病毒载体pMX-Oct4和pMX-Nanog;逆转录病毒系统pMX�
- 邓彦飞刘庆友邓海莹罗婵杨素芳石德顺
- 关键词：水牛NANOG基因克隆异位表达
- 水牛转录因子 c-Myc 克隆和表达研究被引量：3
- 2014年
- 原癌基因c-Myc是诱导多能干细胞(iPSC)生产中重要的转录因子之一。水牛c-Myc的克隆和表达,可以为下一步研究其功能和使用特异性转录因子生产水牛iPSC奠定基础。采用RT-PCR扩增水牛c-Myc编码区(CDS),RT-PCR和免疫荧光技术检测内源c-Myc在水牛胎儿成纤维细胞(BFF)和胃上皮细胞(BSEC)中的表达情况;构建表达c-Myc的逆转录病毒载体(pMX-c-Myc),病毒法转入BFF中,免疫荧光技术分析外源c-Myc在BFF中的表达情况。结果表明:c-Myc在水牛BFF和BSEC中都有表达;水牛c-Myc的CDS全长1 320 bp,氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应蛋白的同源性分别为98%、96%、91%和86%,与小鼠c-Myc蛋白的结构相似;逆转录病毒载体介导的c-Myc能在BFF中表达。
- 邓彦飞石德顺刘庆友邓海莹罗婵杨素芳
- 关键词：IPS细胞真核表达水牛
- 水牛转录因子Klf4基因编码区序列克隆及在真核细胞中表达研究
- 2013年
- Krüppel样因子4(Klf4)在调控细胞增殖、分化和胚胎发育中有重要作用,也是生产诱导多能干细胞(iPSC)重要的转录因子之一。本研究对水牛Klf4进行克隆和表达研究,为生产水牛iPSC和研究其在体细胞重编程中的机理奠定基础。采用RT-PCR克隆并分析水牛Klf4编码区序列(CDS);mRNA水平和蛋白水平检测Klf4在水牛胎儿成纤维细胞(BFF)和胃上皮细胞(BSEC)中的表达情况;构建表达水牛Klf4的逆转录病毒载体(pMX-Klf4)、病毒感染BFF、免疫荧光技术分析外源Klf4在BFF中的表达情况。结果表明:水牛CDS全长1 434 bp,氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸序列的相似性分别为99%、97%、92%和92%,蛋白结构保守;内源Klf4在BFF和BSEC中都有表达,pMX介导的外源Klf4能在BFF中表达。
- 邓彦飞石德顺刘庆友邓海莹罗婵杨素芳
- 关键词：水牛KLF4真核表达
