福建省自然科学基金(C0410004)
- 作品数：5 被引量：15H指数：2
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- 人源化抗人肺癌单域抗体基因的构建、表达及活性分析被引量：6
- 2006年
- 目的:构建人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3VH基因,在大肠杆菌中表达,对其蛋白活性进行分析。方法:采用CDR移植技术对mAb3D3的重链可变区进行人源化,通过重叠PCR获得hu3D3VH的基因。构建pET22(b+)/hu3D3VH表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达。表达产物通过Ni亲和层析柱纯化。采用间接ELISA和竞争抑制ELISA法进行活性分析。结果:通过重叠PCR获得序列正确的目的基因。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,目的蛋白的纯度达95%以上。hu3D3VH具有与亲本抗体相同的抗原反应性,并能抑制mAb3D3与L342细胞的结合。结论:获得的人源化单域抗体hu3D3VH,保留了与mAb3D3相同的反应性和特异性,为进一步临床应用奠定了基础。
- 王阶平庄国洪杨桂旺王臻李文珠谢莲英颜江华
- 关键词：人源化活性分析
- 人源化抗人肺癌二价和四价VH单域抗体的制备及活性分析被引量：2
- 2007年
- 目的 为提高人源化的抗人肺癌单域抗体hu3D3va的功能性亲和力，制备其二价和四价的抗体分子。方法 重组PCR分别将SV5-Cys短肽和p53四聚化结构域基因与hu3IY3Va基因融合，而获得同源二聚体dihu3D3vH和同源四聚体tehu3D3Va基因。将两种基因克隆至pET-22b（＋）表达载体，并分别在E-coliB121（DE3）中表达。表达产物通过N^2＋亲和层析柱纯化。用FITC分别标记hu31Y3VH、dihu 31Y3VH和tehu3D3VH三种抗体分子，通过免疫荧光实验分析其抗原反应性和特异性，并利用流式细胞术比较分析其功能性亲和力。结果 两种基因均以单体形式并主要以包涵体的形式表达，纯化并复性后，其蛋白溶液中分别存在约50％的二聚体和70％的四聚体。dihu3D3VH和tehu3D3VH均保留了hu3IY3VH的抗原反应性和特异性；且与hu3D3VH相比，其功能性亲和力分别提高了约60％和160％。结论 采用增加结合价的策略，有效地改善了hu3D3VH的功能性亲和力。
- 王阶平颜江华张长弓王勇军庄国洪
- 关键词：单域抗体
- 凝血靶向通用效应因子tTF/SA融合蛋白的表达及活性鉴定
- 2007年
- 制备凝血靶向通用效应因子tTF/SA融合蛋白,并鉴定其生物学活性。利用PCR技术构建tTF与链霉亲和素SA的融合基因,克隆至表达载体pET22b(+),在E.coliBL21(DE_3)中表达,镍亲和层析柱纯化tTF/SA融合蛋白。凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白中tTF的活性,ELISA鉴定融合蛋白中SA与生物素Biotin结合的活性。获得序列正确的tTF/SA/pET22b(+)重组子,融合基因在E.coliBL21(DE_3)中高效表达。纯化后的融合蛋白具有活化FⅩ、引起血液凝固的能力,且能与生物素结合。融合基因已成功在E.coliBL21(DE_3)中表达,tTF/SA融合蛋白具有TF和SA活性。融合蛋白tTF/SA可作为通用效应因子,与生物素化的肿瘤组织血管特异性载体联用,实现选择性诱发肿瘤组织血管栓塞的多点治疗。
- 王臻颜江华王阶平谢莲英吴娜
- 关键词：融合蛋白血管栓塞
- 一种新型融合蛋白(RGD)3/tTF的基因表达与活性分析被引量：6
- 2007年
- 为了发展一种新型的融合蛋白(RGD)3/tTF用于肿瘤血管的选择性栓塞治疗,利用PCR技术重组(RGD)3/tTF融合基因,克隆于pET22b(+)载体,表达于E.coliBL21(DE3)。用镍柱纯化融合蛋白。凝血实验与FⅩ活化实验检测融合蛋白tTF组分的活性。间接ELISA分析(RGD)3/tTF与αvβ3的特异结合能力。pET22b(+)/(RGD)3/tTF重组质粒成功获得并表达于E.coliBL21(DE3)。纯化蛋白(RGD)3/tTF能有效诱发血液凝固,活化FⅩ。(RGD)3/tTF与αvβ3的特异结合能力比RGD/tTF提高了32%。新型融合蛋白(RGD)3/tTF已在E.coli系统成功表达,表达蛋白保持tTF的活性并显示比RGD/tTF更高的与αvβ3的结合能力。
- 颜江华杨桂旺王阶平吴娜庄国洪
- 关键词：TTFRGD融合蛋白凝血
- 肺癌靶向血栓蛋白hu3D3V_H-tTF的表达及活性鉴定被引量：2
- 2008年
- 目的制备一种用于肺癌血管靶向栓塞治疗的融合蛋白hu3D3VH-tTF,并鉴定其生物学活性。方法利用重叠PCR技术构建tTF与hu3D3VH的融合基因,克隆至表达载体pET22 b(+),在E.coliBL21(DE3)中表达,镍亲和色谱柱纯化目的蛋白。ELISA检测融合蛋白hu3D3VH组分与肺腺癌细胞A549选择性结合活性,凝血实验和FⅩ活化实验鉴定融合蛋白tTF组分的促凝血活性。结果获得序列正确的hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中高效表达。纯化后的融合蛋白与肺腺癌细胞A549具有选择性结合活性,并能活化FⅩ、有效促发血液凝固。结论成功构建hu3D3VH/tTF/pET22 b(+)重组子,hu3D3VH/tTF融合蛋白具有hu3D3VH的选择性结合能力同时具有TF的促凝血活性,为开展选择性肺肿瘤血管血栓性栓塞研究奠定了基础。
- 颜江华王生育王阶平王勇军黄志平王臻
- 关键词：TTF血栓肺癌
