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马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶基因的克隆、表达及纯化: 2012年; 目的研究马尔尼菲青霉菌(PM)溶血磷脂酶(LysoPLs)基因的克隆、表达和纯化,为研究其致病机制奠定基础。方法采用生物信息学方法,从PM酵母相全长cDNA文库中识别出PMLysoPLs基因的同源序列及其全长编码区。通过PCR方法扩增PMLysoPLs基因的编码区序列,构建原核表达载体pET30a(+)-PMLysoPLs,经DNA序列测定鉴定其序列,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,重组产物采用His-镍蛋白纯化柱进行纯化。结果 PMLysoPLs基因长度为991bp,其全长编码序列长度为732bp,编码243个氨基酸,其编码蛋白理论分子量为26.8kDa。重组表达载体经序列测定及酶切鉴定与理论推测结果相符。经IPTG诱导,该基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中得到高效的可溶性上清表达,纯化后的重组蛋白分子量为25～35kDa,其单一蛋白纯度达95%以上。结论本研究成功构建了PMLysoPLs基因的pET30a(+)原核重组质粒,获得的可溶性重组蛋白表达效率高,可用于进一步研究PM溶血磷脂酶的功能。; 李凌华胡凤玉陈万山宋伟南蔡卫平唐小平; 关键词：马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶克隆原核表达

艾滋病患者马尔尼菲青霉菌rDNA转录间隔区序列分析: 2012年; 目的了解广东省和广西地区AIDS患者马尔尼菲青霉菌（PM）分离株rDNA转录间隔区（ITS）序列的特征和变异。方法AIDS患者PM分离株15株，其中12株来源于广东，3株来源于广西。运用真菌核糖体通用引物ITSl和ITS4，对其rDNAITS进行扩增和测序，测序结果在GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，构建NJ系统树。结果15株PM分离株rDNAITS序列长度为578bp，包括18SrRNA、ITSl、5．8SrRNA、ITS2及28SrRNA，与来源于日本和泰国的PM的rDNAITS序列一致性高达97％～100％，同源性100％；11株广东来源PM和1株广西来源PM菌株rDNAITS序列完全相同，1株广东来源PM和2株广西来源PM菌株的rDNAITS序列存在1个碱基差异；分子进化树显示，PM与毛霉菌、稻根霉菌rDNAITS序列的遗传距离最远，与支顶孢菌、组织胞浆菌及青霉属其他菌种如嗜松青霉、棘孢青霉的rDNAITS序列的种间遗传距离较小。结论广东和广西地区AIDS患者PM分离株的rDNAITS序列非常保守，可作为靶基因来设计PM的种特异性引物，用于菌种鉴定。; 李凌华胡凤玉陈万山宋伟南邝燕玲蔡卫平唐小平; 关键词：马尔尼菲青霉菌获得性免疫缺陷综合征

PCR技术在快速诊断艾滋病合并播散性马尔尼菲青霉菌病中的应用被引量：9: 2011年; 目的探讨PCR技术在快速诊断艾滋病(AIDS)合并播散性马尔尼菲青霉病(PSM)中的应用价值。方法收集21例AIDS合并播散性PSM患者抗真菌治疗前的系列标本:未培养血液、阳性血液培养物和阳性骨髓培养物,以12例健康人血液为阴性对照。提取上述标本的基因组DNA,采用真菌通用引物ITS1和ITS4对基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物测序后与GenBank核酸序列数据库进行比对分析。结果 21份阳性血液培养物、21份阳性骨髓培养物及2份未培养血液标本均扩增出目的条带,而12份健康人血液标本未扩增出条带。阳性PCR产物测序结果与广东、日本、泰国、印度尼西亚的马尔尼菲青霉菌(PM)rDNA ITS序列(登录号分别为AB298970、AB298950、L37406、AJ853738)一致性高达97%～100%,证实为PM。PM与新型隐球菌及烟曲霉菌rDNA ITS序列的遗传距离最远,与青霉菌属其他菌种绳状青霉菌和桔青霉菌rDNAITS序列的遗传距离最近。结论 PCR可敏感、特异的检测出培养阳性标本中PM,并能有效缩短PM检出时间,但直接采用患者血液进行PCR检测的阳性率较低,方法有待改进。; 陈万山李凌华胡凤玉宋伟南邝燕玲蔡卫平唐小平; 关键词：马尔尼菲青霉菌病获得性免疫缺陷综合征 RDNA ITS序列

马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶基因的识别和序列分析及功能预测: 2011年; 目的从马尔尼菲青霉菌（PM）酵母相全长cDNA文库中识别溶血磷脂酶基因，预测其结构和功能，为进一步实验研究提供理论依据。方法利用NCBI在线分析工具对PM酵母相全长cDNA文库进行筛选，识别溶血磷脂酶基因；通过VectorNTIsuite8．0软件包，对其编码蛋白质的各种结构与功能特征进行预测，并构建种系分子进化树。结果筛选得到的基因长1014bp，Blastx分析该基因可能是编码PM溶血磷脂酶的全长基因，完整的开放读码框（ORF）共含729bp，编码243个氨基酸；其编码蛋白的相对分子质量为26800，预测等电点为5．49，疏水氨基酸占47．7％，亲水氨基酸占26．8％，酸性氨基酸占12．7％，碱性氨基酸占12．8％；该蛋白有潜在的2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个蛋白激酶C磷酸化位点和7个N-肉豆蔻酰位点。结论该氨基酸序列属于溶血磷脂酶样功能域特征蛋白酶；与球孢子菌亲源关系最近。通过研究，一个PM溶血磷脂酶基因被成功发现，这为进一步探讨该基因的功能提供了条件。; 李凌华胡凤玉陈万山宋伟南蔡卫平唐小平; 关键词：溶血磷脂酶马尔尼菲青霉菌生物信息学

Genetic diversity analysis of Penicillium marneffei isolated from AIDS patients in Guangdong, China using randomly amplified polymorphic DNA被引量：2: 2012年; LI Ling-huaHU Feng-yuCHEN Wan-shanCAI Wei-pingSONG Wei-nanKUANG Yan-lingTANG Xiao-ping; 关键词：遗传多样性分析随机扩增多态性DNA 艾滋病青霉菌

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广东省自然科学基金(10151006002000000)