中央高校基本科研业务费专项资金(21609407)
- 作品数：13 被引量：20H指数：2
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- 相关机构：暨南大学暨南大学附属第一医院柳州市工人医院更多>>
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- 真核基因重组Sox2及其在小鼠角膜基质细胞中的表达
- 2013年
- 目的基因重组构建具有穿膜活性的核转录因子Sox2真核表达系统,将其转染至小鼠角膜基质细胞,检测其在小鼠角膜基质细胞中的表达。方法利用重叠延伸PCR法重组目的基因Sox2-PTD构建质粒,测序检测重组DNA序列是否克隆正确。确定正确序列后将其转染至小鼠角膜基质细胞。倒置显微镜下观察细胞生长情况,转染后约10d免疫荧光化学鉴定其表达。结果成功构建质粒PCDNA3.1-Sox2-PTD;4个转录因子测序结果显示:Sox2基因测序结果与基因模板序列100%一致;成功转染至小鼠角膜基质细胞中;荧光显微镜下观察可见,Sox2-PTD在细胞浆和细胞核内均有表达,主要分布在细胞核内。结论成功构建核转录因子的真核表达系统,可转染至小鼠角膜基质细胞并引起细胞形态和表型的变化,为真核重组外源蛋白诱导角膜基质细胞转化为多能干细胞奠定基础。
- 李晓霞袁军陈建苏
- 关键词：SOX2角膜基质细胞
- 带有穿膜肽重组PTD-KLF4的制备及活性鉴定
- 2011年
- KLF4是Kruppel样转录因子(kruppel-like factors,KLF)家族中的一员,是维持胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)全能性的重要转录因子。蛋白质转导结构域(protein transd uctiondomain,PTD)能够携带大分子进入细胞。为了获得具有穿膜功能的重组KLF4蛋白,利用原核表达载体PKYB表达KLF4与PTD的融合蛋白PTD-KLF4,用Ni柱纯化融合蛋白并作Westernblotting鉴定。利用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记PTD-KLF4检测其穿越中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary,CHO)细胞细胞膜的能力;用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)检测重组融合蛋白PTD-KLF4结合目的DNA的活性。结果表明:重组PTD-KLF4可以成功进入细胞、定位细胞核内,穿膜效率为(22.29±2.1)%。重组融合蛋白PTD-KLF4引起细胞形态变化,并具有与目标DNA序列特异结合的能力。重组PTD-KLF4的制备为外源蛋白诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,IPSCs)奠定基础。
- 苏航余榕捷刘晓飞王静静李晓霞陈建苏
- 关键词：KLF4荧光共振能量转移
- Maxadilan 对兔角膜上皮细胞的促增殖作用
- 2011年
- 目的探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的PAC1受体特异激动剂Maxadilan对角膜上皮细胞的促增殖作用。方法分离新西兰大白兔角膜上皮细胞,并在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔角膜上皮细胞PACAP的PAC1受体;细胞增殖实验采用CCK-8法检测,角膜上皮细胞培养基中分别加入0.01μmol.L-1、0.03μmol.L-1、0.05μmol.L-1、0.10μmol.L-1、0.15μmol.L-1Maxadilan作为实验组,未加入Maxadilan作为对照组,检测不同浓度的Maxadilan对角膜上皮细胞增殖的影响;流式细胞仪分析0.10μmol.L-1Maxadilan对细胞周期的影响。结果 RT-PCR检测显示兔角膜上皮细胞含有PACAP的PAC1受体;CCK-8法检测显示0.05μmol.L-1、0.10μmol.L-1、0.15μmol.L-1Maxadilan实验组分别比对照组细胞增多29.1%、41.5%、32.5%,与对照组相比差异有统计学意义(P分别为0.001、0.000、0.000);流式细胞仪分析显示0.10欁μmol.L-1Maxadilan组细胞增殖指数平均值为35.98%,与对照组细胞细胞增殖指数平均值29.48%相比,差异有统计学意义(P=0.014)。结论角膜上皮细胞存在PACAP的PAC1受体,Maxadilan对角膜上皮细胞有促增殖作用。
- 招志毅陈建苏余榕捷谭美华李红阳李红阳刘晓飞
- 关键词：MAXADILAN角膜上皮细胞细胞增殖
- 诱导多能干细胞在眼科的研究进展被引量：2
- 2012年
- 2006年诱导多能干细胞（iPSCs）的建立被誉为是干细胞研究领域的重大突破，使得进行患者体细胞来源的干细胞治疗成为可能。近年的研究表明，动物和人的成纤维细胞、B淋巴细胞、神经干细胞、头发角质细胞、胰腺细胞、脐带基质和羊膜的间充质细胞均可重编程成为iPSCs并可通过一定的诱导分化为特定类型的细胞，为多种疾病的特异性治疗提供了新的方法。而iPSCs研究在眼科领域的研究也取得了长足进展。在眼科，iPSCs诱导后可分化为视网膜色素上皮（RPE）细胞、感光细胞和其他视网膜细胞，从而为治疗视网膜退行性病变奠定了基础。与传统的干细胞治疗不同，iPSCs移植治疗相应的疾病避免了传统干细胞治疗所存在的道德伦理及免疫排斥等限制，具有较好的应用前景。就iPSCs的概念、诱导策略及方法、在眼科领域的研究现状、研究中存在的问题及应用前景等方面进行综述。
- 招志毅陈建苏
- 关键词：诱导多能干细胞眼科
- 一种培养原代小鼠角膜基质细胞的新方法被引量：2
- 2011年
- 目的改良小鼠角膜基质细胞分离培养方法 ,为角膜基质细胞生物学和角膜组织工程等研究提供更好的种子细胞。方法采用Dispase酶消化法联合组织块贴壁法分离、培养原代小鼠角膜基质细胞,倒置显微镜下观察细胞生长情况,通过间接免疫荧光化学染色Vimentin表型和RT-PCR检测Vimentin、Lumican和CK12基因表达对培养的细胞进行鉴别。结果倒置显微镜下可见小鼠角膜基质细胞呈三角形和树枝状,细胞间连接明显,可形成网状连接;免疫荧光化学鉴定小鼠角膜基质细胞表达Vimentin阳性;RT-PCR显示Vimentin和Lumican基因表达阳性,CK12表达阴性。结论 Dispase酶消化法联合组织块贴壁法培养可获得具有角膜基质细胞特性的细胞,本方法为体外获得单纯小鼠角膜基质细胞提供了简单高效的途径。
- 李晓霞陈建苏余榕捷苏杭李娟田振彩戴静赵秀丽李红阳招志毅
- 关键词：角膜基质细胞培养小鼠
- PACAP38对兔角膜瓣术后三叉神经节细胞及角膜神经生长的影响被引量：2
- 2010年
- 目的观察垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP38)对培养的兔三叉神经节细胞及角膜瓣术后角膜神经生长的影响。方法从2周龄新西兰白兔中分离三叉神经节细胞,并在神经元基础培养液中进行培养。培养24h后在培养液中分别加入1μmol/LPACAP38(A组)、0.1μmol/LPACAP38(B组),C组培养液中加入PBS。1周后行抗神经纤维丝蛋白(NF200)免疫荧光染色鉴别培养的三叉神经节细胞。27只新西兰白兔右眼行角膜瓣手术,并分为3组,术后1d分别以10μmol/LPACAP38、5μmol/LPACAP38或PBS点眼,共8周,行角膜敏感度测定和NF200免疫荧光染色,评价术后不同时间角膜神经的修复情况。结果 PACAP38培养的三叉神经节细胞有较多神经细胞存活,伸出突触并交织呈网状,A组神经细胞存活最多。角膜瓣手术的3个组角膜敏感度随着术后时间的延长逐渐增加(Ftime=58.196,P=0.00),10μmol/LPACAP38点眼组角膜敏感度恢复最快。10μmol/LPACAP38点眼组和5μmol/LPACAP38点眼组角膜敏感度值明显高于PBS点眼组,差异均有统计学意义(P=0.000,P=0.005)。角膜神经染色示10μmol/LPACAP38点眼组角膜神经密度较5μmol/LPACAP38点眼组和PBS点眼组高,神经干短端多膨大,以出芽方式发出细微的新生神经纤维芽。结论 PACAP38能促进兔三叉神经节细胞增生及诱导神经突形成,可促进角膜敏感性恢复及角膜神经修复再生。
- 赵秀丽陈建苏余榕捷丁勇郑佩娥李晓霞田振彩戴静
- 关键词：垂体腺苷酸环化酶激活肽神经再生角膜
- 有序排列微模板培养角膜基质细胞及其细胞生物学变化
- 2010年
- 目的探讨CO2激光打标机处理的有序排列微模板培养兔角膜基质细胞的生长特征及其细胞生物学变化。方法用CO2激光打标机刻制的聚苯乙烯有序排列微模板培养兔角膜基质细胞,模板沟槽划线间隔距离0.25mm者为窄间隔组,间隔距离1mm者为宽间隔组,平板组作为对照组。将角膜基质细胞悬液以1×105/mL细胞密度接种于培养板中,倒置显微镜下观察细胞生长情况,苏木精-伊红染色观察细胞排列的形态学差异,免疫荧光法检测培养板上细胞的波形蛋白,实时监测显微镜下观察24h窄间隔组细胞的接触指引特性及细胞的动态生长过程。结果培养第1天倒置显微镜下见3组培养细胞贴壁生长状态无明显区别,窄间隔组和宽间隔组细胞逐渐围绕沟槽接触指引生长,表现为有序排列,且窄间隔组较宽间隔组明显。苏木精-伊红染色和免疫荧光染色显示培养的细胞在窄间隔组沟槽的接触指引下呈有序排列,呈现10余层细胞排列的平行板层结构。3组细胞波形蛋白免疫荧光染色均呈阳性反应。实时监测显微镜下可见窄间隔组细胞体部首先贴壁,在接触指引下生长,而细胞在干燥环境下的凋亡始于细胞伪足突起处。结论利用CO2激光打标机制备的有序排列微模板可获得有序排列的角膜基质细胞,有利于在接近生理状态条件下角膜基质层的构建。
- 田振彩陈建苏周平李沁华李晓霞戴静赵秀丽
- 关键词：角膜基质细胞细胞生物学
- 组织工程角膜内皮层移植的研究与应用被引量：2
- 2013年
- 背景:组织工程角膜内皮可以克服角膜内皮移植的短缺并能够改善角膜内皮细胞的质量,其应用前景十分广阔。因此,寻找一种理想的重建角膜内皮方法是组织工程角膜研究领域的重要课题和研究热点。目的:总结并讨论组织工程角膜内皮重建的研究进展。方法:应用计算机检索PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)相关文章,检索时间为2000至2012年,检索词为"corneal endothelial cell,transplantation,tissue engineering",并限定文章语言种类为英语,然后再从中筛选出与主题相关的部分文献。结果与结论:初检得到163篇文章,按主题相关性对文献进一步筛选,最终纳入44篇文章。目前构建单层角膜内皮层的研究较多,也取得了巨大的成绩,但是仍没有一种材料或重建方式可以完全符合临床应用的组织工程的人角膜内皮。每一种材料和方法都各有优缺点,克服这些缺点以及观察在体内的长期影响是今后的发展方向。
- 李善义陈建苏
- 关键词：角膜内皮细胞动物模型国家自然科学基金
- 原子力显微镜观察角膜内皮细胞诱导后诱导多能干细胞的形态学变化被引量：3
- 2012年
- 背景诱导多能干细胞（iPSCs）具有类似胚胎干细胞的分化能力，可以分化为全身各种类型的体细胞，同时不会引起伦理学问题和免疫排斥反应，因此iPSCs有可能作为组织工程角膜内皮重建的种子细胞。目的利用原子力显微镜（AFM）观察人iPSCs与兔角膜内皮细胞（CECs）混合共培养后分化iPSCs的形态学变化，并找出其细胞膜超微结构变化的规律。方法分别培养兔CECs和人MMC-iPSCs细胞系，用免疫组织化学法测定iPSCs细胞的标志物以鉴定iPSCs细胞。将传代后7d的iPSCs与60％融合的CECs在内皮细胞培养基中共培养建立混合共培养模型，利用AFM结合倒置显微镜观察CECs及共培养前后iPSCs的形貌和超微结构变化。结果CECs的长度和宽度分别为（66．93±10．48）μm和（44．85±8．14）μm，共培养前未分化的谮SCs的长度和宽度分别为（12．51±1．40）μm和（10．93±1．69）μm，共培养后分化的iPSCs长度和宽度分别为（36．12±10．29）μm和（31．53±9．65）μm。分化的iPSCs长度和宽度均大于共培养前的iPSCs，差异均有统计学意义（P〈0．05）。分化的iPSCs宽度与CECs比较差异无统计学意义（P〉0．05）。CECs细胞膜表面突起的最大宽度和高度分别为（2．11±1．03）μm和（115．68±92．08）nm，膜表面凹陷为窗孔样凹陷，最大宽度为（1．49±0．65）μm，膜表面结构几何参数均方根粗糙度（Rq）为（39．20±7．82）nm，平均粗糙度（Ra）为（30．37±5．32）nm；未分化的iPSCs细胞膜表面突起为颗粒状，突起的最大宽度和高度分别为（0．39±0．22）μm和（13．11±9．18）nm，膜表面凹陷为虫蚀样，凹陷的最大宽度为（0．34±0．18）μm，Rq和Ra分别为（26．60±4．93）nm和（9．97±3．78）nm；分化的iPSCs细胞膜表面突起为指状，突起的最大宽度和高度分别为（1．91±0．76）μm和（106．55±77．27）nm，膜表面凹陷为�
- 招志毅陈建苏钟敬祥谭美华李善义戴应
- 关键词：诱导多能干细胞角膜内皮细胞原子力显微镜
- 带有穿膜肽PTD的重组Oct4的制备及活性鉴定被引量：3
- 2011年
- 目的:重组蛋白构建细胞转录因子PTD-Oct4。方法:利用重叠延伸PCR法重组目的基因构建质粒pKYB-PTD-Oct4,并转染至E.coli ER2566。镍柱纯化重组蛋白并用Western bloting对其进行鉴定。用异硫氰酸荧光素(FITC)标记PTD-Oct4,检测其穿透中国仓鼠卵巢(CHO)细胞膜的能力;用荧光共振能量转移(FRET)检测重组融合蛋白PTD-Oct4结合目的DNA的活性。结果:成功获得目的蛋白PTD-Oct4,其可以成功进入细胞,定位于细胞核内,穿膜效率为(28.3±2.4)%,并具有与目标DNA序列特异结合的能力。结论:制备重组PTD-Oct4为外源蛋白诱导多能干细胞(IPSCs)奠定基础。
- 李红阳李晓霞余榕捷刘晓飞王静静苏航陈建苏
- 关键词：OCT4
