湖北省卫生厅科研基金(JX3B81)
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
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- 重组VEGF_(165)基因腺相关病毒的包装和鉴定
- 2010年
- 目的包装重组VEGF165基因的无致病性腺相关病毒,以其作为基因载体感染HUVEC细胞并检测其表达,并在体外检测病毒生物学活性。方法从含有VEGF165基因的pET-32a(+)-VEGF165原核表达载体中扩增出VEGF165片段,构建重组骨架质粒pAAV-VEGF165。将此质粒和对照质粒pAAV-GFP分别与腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper用钙-磷共转法转染HEK293细胞,通过同源重组分别产生rAAV-VEGF165和rAAV-GFP重组腺相关病毒。通过real-timePCR法测定病毒滴度后,转染HUVEC细胞并检测其表达,并通过感染HUVEC来检测其促增殖作用。结果扩增出的VEGF165片段成功构建至重组骨架质粒中,pAAV-VEGF165经双酶切和测序鉴定正确。病毒包装效率达90%以上,收获纯化rAAV-VEGF165病毒滴度达6.0×1010pfu/mL。重组腺病毒rAAV-VEGF165能够感染HUVEC细胞并得到显著性表达;与未转染组和GFP组相比,能够显著促进HUVEC细胞的增殖。结论我们成功包装了重组腺相关病毒rAAV-VEGF165,它能够感染HUVEC细胞并高表达VEGF165蛋白,并具有促增殖作用,这为进一步开展VEGF165基因的基因靶向治疗奠定了基础。
- 白育庭闵清查文良高卉万敬枝
- 关键词：VEGF165重组腺相关病毒基因治疗
- 重组VEGF_(165)基因表达与活性检测
- 2008年
- 目的为血管内皮生长因子(VEGF165)生物学分子机制的研究奠定基础。方法用RT-PCR法从人胎肝总RNA中逆转录扩增VEGF165,将其插入表达载体pET-32a(+)Vector中,将测序鉴定正确的重组表达载体转化至E.Coli XL-Blue中表达,并用纯化蛋白刺激人脐静脉内皮细胞,检测其促增殖活性。结果经异丙基硫代-βD-半乳糖苷(IPTG)诱导后,VEGF165(His)6得到有效表达,Western blot分析可以观察到相对分子质量为26kD的诱导表达条带,该表达蛋白可与VEGF多克隆抗体发生特异性反应。用His-bind亲和层析纯化得到纯度较高的目的蛋白,该蛋白可促进内皮细胞增殖。结论基因工程技术可使大肠杆菌有效表达人VEGF165,并得到纯度较高、有增殖活性的VEGF蛋白;此为进一步研究VEGF的生物学分子机制奠定了基础。
- 白育庭闵清查文良高卉万敬枝
- 关键词：VEGF165基因克隆纯化增殖
