国家自然科学基金(31072138)
- 作品数：11 被引量：40H指数：3
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- 干扰素压力下传代的猪繁殖与呼吸综合征病毒对ISG56转录的影响
- 2015年
- 为探究猪干扰素-β(swIFN-β)加速猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异是否对病毒致病机制存在影响,将PRRSV GD07在干扰素压力下传代至第70代,同时构建SYBR Green实时荧光定量PCR方法,研究干扰素压力下传代毒株(PRRSV GDβfn)、自然条件下传代毒株(PRRSV GDfn)和原代毒株(PRRSV GDf1)等对干扰素诱导基因56(IFN-stimulated gene-56,ISG-56)转录的影响。结果显示,PRRSV能够抑制由干扰素诱导产生的ISG56的转录,其抑制能力大小依次为PRRSV GDβf20>PRRSV GDf20、PRRSV GDβf50>PRRSV GDf50、PRRSV GDβf70>PRRSV GDf70;不同代次之间PRRSV GDf1>PRRSV GDf20/PRRSV GDβf20>PRRSV GDf50/PRRSV GDβf50>PRRSV GDf70/PRRSV GDβf70。结果说明,构建的荧光定量方法能够检测出不同PRRSV毒株在抑制ISG56转录上的差异;随着在细胞上传代次数的增加,PRRSV GDβfn和PRRSV GDfn对ISG-56转录的抑制能力均逐渐减弱;在同一代次中,PRRSV GDβfn对ISG-56转录的抑制能力要强于PRRSV GDfn。
- 熊志轩苏丹萍尤刘阳张显浩陈瑞爱倪挺张必兴贺东生
- 关键词：实时荧光定量PCR猪繁殖与呼吸综合征病毒
- hPRRSV GD07株Nsp2基因真核表达载体的构建和表达
- 2013年
- 为了深入研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2蛋白的免疫特性、结构与功能,试验根据GenBank公布的PRRSV CH-1a株Nsp2基因的核苷酸序列设计1对特异性引物,PCR扩增目的基因,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Nsp2,并对其进行经PCR、双酶切鉴定及DNA序列测定;将构建的重组质粒转染到Marc-145细胞中,用SDS-PAGE、Western-blot对表达产物进行鉴定。结果表明:RT-PCR扩增出的Nsp2基因大小与预期一致,经SDS-PAGE及Western-blot鉴定Nsp2蛋白在Marc-145细胞中成功表达。
- 牛晓芸王艳丽钟望贺东生
- 免疫抗体压力下PRRSV GD株Nsp2和GP5基因变异分析
- 2012年
- 以PRRSV GD-2007株为材料,在自然条件和抗体压力下连续传至40代后,分别命名为PRRSV-GD-f 40和PRRSV-GDAb-f 40,进行RT-PCR,扩增Ns p2基因部分序列和GP5基因全长,克隆并测序。应用序列分析软件将测序结果和已经发表的PRRSV毒株进行比对,结果显示:Nsp2基因扩增片段大小均为796 bp,自然传代和抗体压力下传代后的新毒株和母源毒株的相似性分别为98.0%和97.9%;扩增的GP5基因大小为603 bp,编码200个氨基酸,和母源毒株的相似性分别为99.2%和98.8%。
- 牛晓芸李康宁贺东生
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2GP5
- PRRSV-GP5蛋白对干扰素调节因子-3磷酸化的影响被引量：1
- 2014年
- 为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)-GP5蛋白对干扰素调节因子-3(IRF-3)磷酸化的影响,试验根据PRRSV CH-1a毒株核苷酸序列,设计并合成用于扩增PRRSV-GP5基因的特异引物,将目的基因扩增产物与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,转染Marc-145细胞,间接免疫荧光试验鉴定目的蛋白的表达,应用SDS-PAGE和Western-blot分析GP5对IRF-3的影响。结果表明:经RT-PCR扩增,得到的GP5基因大小与预期一致;间接免疫荧光试验证明,GP5蛋白在Marc-145细胞中成功表达;SDS-PAGE和Western-blot分析显示,GP5基因可以抑制IRF-3的磷酸化。
- 牛晓芸王艳丽熊志轩张显浩李康宁贺东生
- 关键词：GP5基因真核表达
- 华南地区猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其S基因抗原表位片段的遗传变异分析被引量：14
- 2013年
- 应用RT-PCR方法对华南地区某大型猪场疑似猪流行性腹泻病料检测,选取阳性病料接种到Vero细胞,命名为CH/GDGZ/2012(简称GD-12)株。用病毒RNA抽提物为模板,对GD-12的S基因抗原区片段的扩增、克隆后进行核苷酸测序。序列分析表明,CH/GDGZ/2012与CV777、Chinju99、Br1/87、DR13和SM98的核苷酸序列同源性分别为96.9%、93.0%、95.7%、96.7%和96.0%,氨基酸序列的同源性分别为97.7%、91.5%、95.4%、98.0%和94.8%。进化树分析结果显示,华南地区CH/GD-01/2011、CH/GDGZ/2012、GDHSY/2011、CH/GXQZ/2011毒株与经典毒株的遗传距离较大,处于不同的亚群。研究表明,PEDV GD-12株已发生遗传变异、关键抗原表位发生较大变化,该研究可为诊断和防控该病提供参考。
- 田野苏丹萍蒋伟钟望张显浩陈瑞爱贺东生
- 关键词：猪流行性腹泻S基因
- 猪β-干扰素的基因改造表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定被引量：4
- 2011年
- 本研究根据GenBank上登录的猪β-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(mPoIFNβ),在保持原猪β-干扰素蛋白序列不变的基础上,对猪β-干扰素基因进行了毕赤酵母偏嗜性改造,并构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ。pPICZαC-PoIFNβ经SacⅠ酶切线性化后,电击转化导入感受态的毕赤酵母菌株X-33中,转化子经YPDS+Zeocin抗性平板筛选和PCR鉴定后获得多株阳性菌株。阳性酵母菌株经甲醇诱导分泌表达了重组PoIFNβ,其表达量约为127.9mg/L。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,结果表明,表达产物为分子质量约25和28ku的混合物,并且二者都可与PoIFNβ阳性血清结合。以细胞病变抑制法测定重组β-干扰素在BHK-21细胞上的抗水泡性口炎病毒活性为2.8×103 IU/mL;对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上抗病毒活性达到1.6×103 IU/mL。
- 张显浩苏丹萍张艳萍蒋爱翔贺东生
- 关键词：分泌表达抗病毒活性猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪干扰素-β免疫压力下传代后的变异研究被引量：1
- 2012年
- 为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在猪干扰素-β(swIFN-β)免疫压力下的分子变异情况,本研究将高致病性PRRSV JXA1株在添加适量swIFN-β的Marc-145细胞中连续传20代后,获得PRRSV-A1βf20株及正常传代对照株PRRSV-A1f20。序列分析结果显示:PRRSV-A1βf20与PRRSV-A1f20在NSP2、ORF3、ORF5和ORF6等基因中累计分别出现43个和14个核苷酸突变,并分别导致24个和6个氨基酸改变,有义突变与沉默突变比值(NS/S)分别为3和0.625,两者的氨基酸突变速率比为400%。PRRSV-A1βf20株的ORF5、NSP2、ORF3和ORF6的氨基酸突变率为4.5%、3.8%、2.3%和0.57%,NS/S比值为7、3.3、2和1,远高于PRRSV-A1f20株氨基酸突变率和NS/S比值。上述结果表明:在swIFN-β存在时,PRRSV变异显著加快,呈现明显的压力选择性突变;swIFN-β的选择压力对PRRSV的ORF5基因变异影响最大,NSP2次之,属于免疫突变正向效应,而对ORF3基因影响最小,对ORF6几乎无影响。推测PRRSV的NSP2和ORF5基因可能在PRRSV对swIFN-β的免疫逃逸中起重要作用。本研究首次报道了PRRSV在swIFNβ免疫压力下遗传变异加快的正向效应。
- 蒋爱翔苏丹萍胡静牛晓芸陈瑞爱贺东生
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 猪IFN-β免疫压力下猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异被引量：1
- 2014年
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GD07株在Marc-145细胞中在添加或不添加猪干扰素-β(swIFN-β)免疫压力条件下连续传代,将获得的新毒株进行病毒生物学分析、序列测定和IFN-βmRNA水平检测。结果显示,传代后病毒效价逐渐降低,swIFN-β对自然传代和免疫压力下传代毒株的抑制作用下降,且对swIFN-β免疫压力下传代毒株的抑制作用下降的程度较大。序列分析表明,ORF3和ORF5序列的变异导致氨基酸发生变异。荧光定量RT-PCR检测表明,swIFN-β免疫压力下传代病毒感染Marc-145细胞的IFN-βmRNA水平低于自然传代毒株的相应指标,两者均远低于poly(I∶C)刺激细胞后的IFN-βmRNA水平。结果表明,swIFN-β免疫压对PRRSV的遗传变异有正向加速作用。
- 王艳丽牛晓芸熊志轩张显浩贺东生
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病和副猪嗜血杆菌病混合感染的诊断与防制被引量：17
- 2012年
- 目前在集约化养殖场的猪群中经常出现病毒病和细菌病的混合感染,严重影响中国养猪业的发展。2011年9月,广东某个千头母猪场的猪群大量发病,表现为高热、咳嗽、食欲下降、皮肤发绀、关节肿大等临床症状。通过流行病学调查、剖检、细菌分离鉴定、药敏试验、PCR和RT-PCR等实验室检测最终确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病和副猪嗜血杆菌病的混合感染,在此基础上提出和实施了该病的防控方案。
- 苏丹萍王文豪张显浩张丹琳贺东生
- 关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒猪圆环病毒副猪嗜血杆菌
- 抗体免疫压力下猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3和ORF5基因变异研究
- 2012年
- 本试验旨在对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在抗体免疫选择压力下分子变异情况进行研究。将HPPRRSV-JXA1株在添加适量抗体或不添加抗体的Marc-145细胞上连续传代各30代,获得毒株JXA1-Abf30和JXA1-f30。对传代前后毒株的ORF3和ORF5基因进行扩增、克隆和序列分析,研究结果显示,JXA1-Abf30和JXA1-f30在ORF3和ORF5基因上核苷酸发生突变位点数累计分别为18和9个,氨基酸发生突变位点数累计分别为15和3个。JXA1-Abf30和JXA1-f30的核苷酸突变速率比为186%,氨基酸突变速率比为500%,非同义突变(NS)与同义突变(S)比值(NS/S)分别为5.0和0.5。此外,抗体压力下传代的毒株ORF5基因有4个碱基位点发生稳定的非同义突变,其中2个(AA31和AA190)与已知抗原表位有关。由研究结果可知,抗体压力下传代的PRRSV的突变速率和非同义突变数目明显高于无抗体压力下的传代毒株;抗体免疫选择压能显著影响PRRSV的ORF5基因变异,并呈现明显的压力选择性突变,对ORF3基因变异的影响小于ORF5基因。
- 胡静蒋爱翔牛晓芸苏丹萍陈瑞爱贺东生
- 关键词：PRRSVORF3ORF5基因变异
