国家自然科学基金(30700034)
- 作品数：6 被引量：21H指数：2
- 相关作者：严杰林旭瑷丁士标王欢赵欣更多>>
- 相关机构：浙江大学昆明医科大学甘肃中医药大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金浙江省自然科学基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 细菌溶血素毒性和致病机制研究进展被引量：14
- 2018年
- 许多病原菌能产生溶血素溶解红细胞,但近年发现细菌溶血素还能损伤或致死多种有核细胞和血小板。根据分子结构、结合细胞方式、膜孔道形成机制等不同,可将大多数细菌溶血素分类为重复子毒素家族(repeats in toxin family,RTX)和胆固醇依赖细胞溶素家族(cholesterol-dependent cytolysin family,CDC)毒素。细菌溶血素可通过膜损伤、细胞溶解或裂解、离子失衡相关病变、细胞凋亡或坏死性凋亡以及TLR2/4介导的NF-κB、p38MAPK、JNK信号传导通路和NLRs介导的NLRP3炎症小体引发强烈的炎症反应并导致炎症性组织损伤,从而在细菌感染过程中发挥重要致病作用。
- 马碧书马丽娜林旭瑷严杰
- 关键词：膜损伤细胞裂解
- 钩端螺旋体多抗原肽的构建及免疫性分析
- 2008年
- 目的构建问号钩端螺旋体（简称钩体）主要外膜蛋白OmpL1、LipL21和LipL32优势抗原表位的串联基因及其表达系统，了解该重组蛋白的免疫活性。方法采用噬菌体M13KE表面展示技术结合Western blot分析，鉴定了OmpL1、LipL21和LipL32的优势抗原表位，人工合成优势抗原表位串联基因并构建其原核表达系统。SDS—PAGE检测重组蛋白的表达情况；Western blot及ELISA鉴定重组蛋白的免疫活性。结果该合成基因在原核表达系统中得到了有效表达，且表达产物主要以可溶性形式存在。Western blot和ELISA结果显示该重组蛋白能与兔抗钩体全菌抗体及不同血清群的钩体病人血清中的抗体产生免疫反应。结论本研究成功构建了钩体多表位串联基因及其表达系统，所表达目的蛋白具有良好的免疫活性，且对不同血清群型抗体之间均有免疫原活性。
- 林旭瑷隋玉娟毛亚飞严杰
- 关键词：钩端螺旋体病多抗原肽免疫活性
- 问号钩端螺旋体鞘磷脂酶类溶血素基因功能分析及其感染细胞后转录水平变化
- 2009年
- 目的了解问号钩端螺旋体（简称钩体）鞘磷脂酶类溶血素基因sph1—sph4产物溶血活性及其感染细胞后转录水平的变化。方法以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株、波摩那群波摩那型罗株和非致病性双曲钩体三宝垄群Patoc型PatocⅠ株基因组DNA为模板，采用PCR扩增全长sph1-sph4基因片段，扩增产物T—A克隆后测序。构建sph1—sph4基因原核表达系统，采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rSph1—rSph4的表达情况，Ni—NTA亲和层析柱提纯rSph1—rSph4。采用绵羊血平板对rSph1～rSph4溶血活性进行鉴定，实时荧光定量RT—PCR检测问号钩体赖株感染J774A.1细胞前后sph1～sph4基因转录水平的变化。结果问号钩体赖株和罗株基因组DNA中均能扩增sph1～sph4基因，双曲钩体PatocⅠ株则否。与报道的相应基因序列比较，所克隆的sph1—sph4基因核苷酸序列相似性均为100％。所构建的原核表达系统能分别表达目的重组蛋白rsph1～rSph4。rSph1～rSph4均有溶血活性，其中以rSph2溶血活性最强。问号钩体赖株感染J774A．1细胞后，sph1—sph4基因转录水平均上调，其中sph2和sph4基因mRNA水平上调更为明显。结论sph1—sph4基因仅存在于致病性问号钩体中，其表达产物有溶血活性。问号钩体赖株感染细胞后sph1～sph4基因转录水平的上调，提示此类鞘磷脂酶类溶血素可能在问号钩体感染宿主过程中有重要作用。
- 赵金方林旭嫒严杰
- 关键词：问号钩端螺旋体溶血活性转录水平
- 钩端螺旋体溶血素Sph2表达模式及诱导巨噬细胞和肝细胞凋亡活性被引量：1
- 2010年
- 目的 了解问号钩端螺旋体（简称钩体）感染细胞前后sph2基因表达水平变化,确定鞘磷脂酶类溶血素Sph2及诱导细胞凋亡的活性.方法 采用PCR从黄疸出血群赖型赖株钩体基因组DNA中扩增全长sph2基因片段,T-A克隆后测序.构建sph2基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检查重组Sph2（rSph2）的表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rSph2.采用绵羊血平板溶血试验及血红蛋白分光光度法测定rSph2的溶血活性.采用流式细胞术检测rSph2诱导小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1和肝细胞株IAR20凋亡的活性,实时荧光定量PCR检测赖株钩体感染J774A.1和IAR20细胞前后sph2基因mRNA水平变化.结果 与GenBank中sph2基因比较,所克隆的sph2基因序列相似性为100%.所构建的原核表达系统能高效表达rSph2.rSph2以浓度依赖方式溶解绵羊红细胞.10 μg/ml rSph2可诱导J774A.1和IAR20细胞凋亡,凋亡率峰值分别为23.96%和32.92%.赖株钩体感染J774A.1和IAR20细胞后0.5～2 h内sph2基因mRNA水平显著升高,2 h后mRNA水平迅速下降.结论 钩体sph2基因呈宿主细胞接触式瞬时表达.rSph2有溶解绵羊红细胞及诱导巨噬细胞和肝细胞凋亡的活性,因而Sph2是钩体致病过程中重要的毒力因子.
- 丁士标林旭瑷王欢严杰
- 关键词：问号钩端螺旋体溶血活性
- 问号钩端螺旋体侵入单核-巨噬细胞方式及其吞噬泡形成差异性研究
- 2010年
- 目的 探讨问号钩端螺旋体（简称钩体）侵入人或鼠单核-巨噬细胞方式及其吞噬泡形成差异性.方法 采用透射电镜观察问号钩体黄疸出血群赖型赖株侵入小鼠单核-巨噬样细胞J774A.1和佛波酯（PMA）激活的人单核细胞THP-1后吞噬泡形成情况.采用免疫荧光联合激光共聚焦显微镜及荧光分光光度仪等方法,观察细胞内吞抑制剂单丹磺酰尸胺（MDC）、氧化酚砷（PAO）阻断及内吞相关网格蛋白抗体封闭前后,J774A.1细胞和PMA激活的THP-1细胞内问号钩体赖株数量的变化.结果 J774A.1细胞内问号钩体存在于吞噬泡内,THP-1细胞内问号钩体无吞噬泡膜包绕.MDC和PAO能以剂量依赖方式抑制J774A.1和THP-1细胞内吞问号钩体,其中10 μmol/L以上MDC和1 μmol/L以上PAO阻断的J774A.1和THP-1细胞内问号钩体数量明显少于未阻断细胞（P＜0.05）.网格蛋白抗体封闭后,J774A.1和THP-1细胞内问号钩体数量也明显减少（P＜0.05）.结论 问号钩体以网格蛋白依赖性内吞途径侵入人或鼠单核-巨噬细胞.人或鼠单核-巨噬细胞内问号钩体吞噬泡形成有明显差异,这可能是人或鼠感染问号钩体后发病情况不同的原因之一.
- 王欢王艳芳丁士标严杰林旭瑷
- 关键词：问号钩端螺旋体
- 钩端螺旋体脂多糖诱导J774A.1细胞凋亡及相关信号通路调控作用的研究被引量：6
- 2010年
- 目的 了解问号钩端螺旋体脂多糖（L-LPS）体外诱导小鼠单核-巨噬样细胞株（J774A.1）凋亡及Toll样受体（TLR）和相关信号通路调控细胞凋亡的作用.方法 酚水法从问号钩体黄疸出血群赖型赖株中提取L-LPS.流式细胞术测定L-LPS诱导J774A.1细胞凋亡及FasL中和抗体阻断细胞凋亡的作用.实时荧光定量RT-PCR（qPCR）及流式细胞术检测L-LPS作用前后J774A.1细胞Fas/FasLmRNAs和蛋白表达水平变化.TLR2或TLR4抗体封闭试验、信号通路阻断试验及流式细胞术,检测TLR2、TLR4及p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和胞外信号调节激酶（ERK）通路对L-LPS诱导细胞凋亡的调控作用.结果 100 ng/ml L-LPS作用J774A.1细胞4、12和24 h的凋亡率分别为56.50%、69.28%和24.35%,FasL中和抗体封闭后,细胞凋亡率分别下降至11.21%、21.58%和12.70%（P＜0.05）.L-LPS作用4、12和24 h的J774A.1细胞FasL和Fas mRNAs水平分别为正常细胞的1.34、2.12、2.10及2.45、3.87、3.12倍（P＜0.05）,FasL和Fas蛋白表达率分别从L-LPS作用前的4.82%和15.32%上调至18.61%、60.13%、42.75%（P＜0.05）和76.34%、85.70%和77.92%（P＜0.05）.TLR2抗体封闭后L-LPS诱导J774A.1细胞的凋亡率（11.54%）明显低于未封闭细胞（66.56%,P＜0.05）,但TLR4抗体封闭细胞的凋亡率仍高达55.27%（P＞0.05）.p38MAPK与JNK通路阻断后L-LPS诱导J774A.1细胞凋亡率（20.54%和47.98%）明显低于未阻断细胞（62.17%,P＜0.05）,ERK通路阻断后细胞凋亡率仍高达61.72%（P＞0.05）.结论 L-LPS经TLR2识别后通过p38MAPK和JNK通路上调J774A.1细胞Fas和FasL表达,从而参与L-LPS诱导细胞凋亡过程.
- 李世军陈明环赵欣严杰
- 关键词：问号钩端螺旋体脂多糖FAS/FASL
