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CFSE标记结合流式细胞术在研究NK细胞分裂与杀伤功能中的应用被引量：7: 2010年; 目的建立并优化CFSE标记结合流式细胞术检测人NK细胞分裂、增殖和杀伤功能的方法。方法利用CFSE标记磁珠纯化的人NK细胞,加或不加IL-2进行培养。分别在第3、5、7天收集细胞,流式细胞术对NK细胞的分裂增殖进行检测;利用IL-2活化NK细胞作为效应细胞,与靶细胞(K562细胞)按不同效靶比在37℃5%CO_2培养箱共孵育4 h加入碘化丙啶(PI),流式细胞术检测CFSE^+PI^+K562细胞(死亡的靶细胞)的百分率。结果CFSE标记的NK细胞在IL-2的作用下第5天即可观察到细胞增殖,至第7天80%以上的NK细胞均发生增殖,分裂1～6次。在对NK细胞杀伤功能的研究中,发现IL-2刺激后NK细胞的杀伤功显著增强。此外,当IL-2或IL-12活化的NK细胞作用于不同的靶细胞时,均可有效地杀伤靶细胞。结论以CFSE标记技术结合流式细胞术可在单细胞水平客观精确地对NK细胞的增殖、分裂和杀伤功能进行分析。本方法灵敏度高、操作简便易行、重复性好,对其他淋巴细胞亚群功能的研究具有重要的借鉴意义。; 范艳莹吴长有; 关键词：CFSE NK细胞细胞分裂杀伤功能

卡介苗(BCG)通过诱导IL-12产生和受体表达促进人NK细胞功能被引量：6: 2009年; 目的:研究卡介苗(BCG)对人自然杀伤细胞(NK)功能的作用及其机制。方法:分离抗结核抗体阴性志愿者外周血PBMC、纯化NK细胞,分别与BCG、IL-12、BCG+IL-12、BCG+抗IL-12Rβ1 mAb(2B10)培养。利用ELISA方法检测培养上清液IFN-γ、IL-12p40含量;利用ELISpot方法检测IFN-γ、颗粒酶B产生细胞的频率;利用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定杀伤功能。利用流式细胞术检测NK细胞IL-12Rβ1的表达。结果:BCG呈剂量依赖的方式诱导PBMC产生IFN-γ。在BCG刺激条件下,PBMC颗粒酶B分泌细胞数明显高于不加任何刺激剂组(P<0.05)。BCG增强PBMC杀伤活性。BCG不能诱导纯化NK细胞产生IFN-γ,但与IL-12同时刺激则表现出协同作用。纯化NK细胞经BCG刺激后杀伤活性与未刺激相比差异无统计学意义。BCG呈剂量依赖方式诱导PBMC产生IL-12、并促进NK细胞不同亚群表达IL-12Rβ1。2B10抗体抑制BCG对PBMC产生IFN-γ和分泌颗粒酶B的诱导作用。结论:BCG间接地促进NK细胞的生物学活性,其部分机制是通过诱导单核细胞产生内源性IL-12、并上调NK细胞表达IL-12R。; 周晖范艳莹吴长有; 关键词：卡介苗自然杀伤细胞外周血单个核细胞

Toll样配体(R-848)与IL-12对人NK细胞亚群IFN-γ产生的作用被引量：10: 2007年; 目的:研究Toll样配体(R-848)与IL-12对人NK细胞IFN-γ产生的作用和细胞亚群分析。方法:分离人外周血PBMC和纯化的NK细胞,分别与R-848、IL-12或R-848和IL-12共同培养。利用ELISA法检测培养上清中IFN-γ的水平,再利用流式检测并分析产生IFN-γ的NK细胞亚群。结果:正常人PBMC分别与不同浓度的Toll样配体R-848、LPS、CpG培养后,均以剂量依赖的方式诱导IFN-γ的产生,但以R-848的效果最佳。细胞亚群分析的结果表明,R-848对CD4+T和CD8+T细胞IFN-γ的表达无明显作用,但显著地促进CD56+细胞表达IFN-γ。同样地,在IL-12刺激之下,CD56bright和CD56dimNK细胞表达IFN-γ。当R-848和IL-12与PBMC和纯化NK细胞孵育后,对CD56bright和CD56dimNK细胞IFN-γ的表达具有协同作用。结论:Toll样配体与NK细胞Toll样受体结合后,促进CD56brightNK细胞亚群IFN-γ的产生,而且Toll样配体与IL-12具有协同作用,提示Toll样受体与细胞因子在调控NK细胞的生物活性中发挥着十分重要的作用。; 尹凌凡范艳莹李丽吴长有; 关键词：NK细胞

绿脓杆菌制剂与IL-12在诱导人NK细胞IFN-γ产生中的协同作用被引量：22: 2007年; 探讨绿脓杆菌制剂(piliated Pseudomonas Aeruginosa,PPA)与IL-12协同诱导人PBMC和NK细胞IFN-γ的产生。分离健康人PBMC和纯化NK细胞分别与培养液、PPA、IL-12或PPA+IL-12共同培养,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测无细胞培养上清中IFN-γ的水平。同时采用流式细胞仪在单个细胞水平上分析PPA和IL-12诱导IFN-γ产生的淋巴细胞亚群。结果显示,单独应用亚适剂量的IL-12或PPA刺激人PBMC或纯化NK细胞,不能诱导或只能诱导低水平IFN-γ的产生。当PPA和IL-12共同与人PBMC或纯化NK细胞孵育后,PPA呈时间和剂量依赖性与IL-12协同诱导PBMC和纯化NK细胞产生大量IFN-γ。细胞亚群分析的结果表明,PPA和IL-12协同诱导CD56+NK细胞产生IFN-γ,但对CD4+T和CD8+T细胞无明显作用。PPA与IL-12协同促进NK细胞IFN-γ的产生,提示PPA和IL-12能直接刺激NK细胞发生免疫应答。; 刘昀范艳莹李丽尹凌凡杨滨燕张宜俊吴长有; 关键词：NK细胞绿脓杆菌制剂 IFN-Γ IL-12

未甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸对小鼠脾细胞产生免疫球蛋白E的抑制作用被引量：4: 2007年; 【目的】探讨未甲基化CpG的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)在体外对小鼠脾细胞和纯化B细胞产生免疫球蛋白E(IgE)的作用及其机制。【方法】在体外,小鼠脾淋巴细胞和纯化B细胞与白细胞介素4(IL-4)+抗CD40单克隆抗体(anti-CD40)在CpG ODN存在或不存在的条件下刺激3d或7d后,用酶联免疫吸附试验法检测IgE的水平,用流式细胞仪检测CD19阳性B细胞的分裂及活化情况。【结果】CpG ODN呈剂量及时间依赖性地抑制由IL-4+anti-CD40诱导的小鼠脾细胞IgE的产生,anti-IFN-γmAb及anti-IL-12mAb不能完全拮抗CpG ODN对IgE产生的抑制作用。同样地,CpG ODN抑制小鼠纯化B细胞IgE的产生。进一步分析结果表明,CpG ODN促进B细胞活化及共刺激分子CD80的表达,但抑制B细胞分裂。【结论】CpGODN直接作用于B细胞而发挥对IgE的抑制作用,该研究为基础和临床研究提供科学理论依据。; 谢海瑞沈二霞李文益吴长有; 关键词：CPG ODN 脾细胞小鼠

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国家自然科学基金(30671898)