青岛市科技局基金(05-12-NS-29)
- 作品数：4 被引量：12H指数：4
- 相关作者：于红张文卿李丹吕锐徐腾飞更多>>
- 相关机构：青岛大学青岛大学医学院附属医院更多>>
- 发文基金：青岛市科技局基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重组人IL-12在CHO细胞中高效表达克隆的筛选及产物的生物学活性分析被引量：4
- 2008年
- 目的:重组人白细胞介素-12(rhIL-12)真核表达质粒(pcDNA6/v5-his-p70)转染CHO细胞,筛选高效稳定表达克隆;并对表达产物进行生物学活性分析。方法:采用聚乙烯亚胺(PEI)将pcDNA6/v5-his-p70转入CHO细胞;用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选阳性表达克隆,并进行单克隆扩增;RT-PCR进行表达鉴定;ELISA检测各克隆rhIL-12的表达量;应用淋巴细胞增生实验及细胞内细胞因子染色方法分析rhIL-12的生物学活性。同时,对筛选出的阳性克隆进行表达稳定性观察。结果:RT-PCR结果显示,选取的20个阳性克隆均可扩增出1800bp的特异性片段;ELISA表明,其中6个克隆rhIL-12表达水平较高(312.69～719.10ng/L),最高表达量达到719ng/L(5×104个细胞,48h);生物学活性分析表明,表达的rhIL-12可明显提高献血员外周血PBMC对PHA/HCMV反应的CD4/IFN-γ及CD8/IFN-γ双标记阳性细胞克隆的频数;并且,可明显提高献血员外周血PBMC对PHA/HCMV刺激的增生反应效能。阳性克隆在维持量的筛选药物(2ng/LBlasticidin)压力下传代6个月,其表达水平无明显变化。结论:rhIL-12真核表达载体(pcDNA6/v5-his-p70)能在CHO细胞中高效稳定表达;其表达产物具有良好的生物学活性。
- 吕锐张文卿于红李丹
- 关键词：白细胞介素-12中国仓鼠卵巢细胞基因表达
- 重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选被引量：5
- 2009年
- 目的:构建人表皮生长因子受体(HER2)胞外区(1896bp)基因的真核表达质粒(pcDNA6/v5-his-HER2),转染小鼠乳腺癌细胞(EMT6),获得其稳定表达细胞株(EMT6/HER2)。方法:用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1-HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列;经酶切、连接构建pcDNA6/v5-his-HER2;转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,对其进行酶切及测序鉴定;以PEI法将pcDNA6/v5-his-HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1～2周,获得抗性克隆EMT6/HER2;用RT-PCR检测EMT6/HER2中HER2mRNA,免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。结果:PCR产物与预期片段大小一致;pcDNA6/v5-his-HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后,可见与PCR产物大小相同的片段;DNA测序结果显示,pcDNA6/v5-his-HER2中HER2基因序列无误,读码框正确;用RT-PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2mRNA,免疫组化法证实,EMT6/HER2中有HER2的阳性信号。结论:成功地构建了HER2胞外区真核表达载体,获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株,为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。
- 徐腾飞张文卿于红李丹
- 关键词：真核表达转染
- 重组人IL-12真核表达载体的基因佐剂功能被引量：4
- 2008年
- 目的探讨重组人IL-12真核表达载体(pcDNA6-p70)对核酸疫苗(HCMV pp65基因重组腺病毒,Adeno-pp65)的基因佐剂功能。方法pcDNA6-p70与Adeno-pp65共免疫BALB/c小鼠,每2周1次,共4次,同时设立Adeno-pp65对照组及生理盐水对照组。于初次免疫后第6周末尾静脉取血,第9周处死小鼠,分离脾细胞,分别检测细胞内细胞因子水平、CTL杀伤活性、特异性淋巴细胞增生和IFN-γ水平,并观察pcDNA6-p70对小鼠的安全性。结果共免疫组HCMV特异性CD4/IFN-γ、CD8/IFN-γ双标记阳性细胞的百分率均高于Adeno-pp65组及生理盐水对照组,差异均有显著意义;其CTL杀伤活性、HCMV特异性淋巴细胞增生水平及脾淋巴细胞特异性IFN-γ释放水平均高于Adeno-pp65组和生理盐水对照组,差异均有显著意义。pcDNA6-p70肌肉注射昆明小鼠,其体温、体重及一般情况与对照组差异均无显著意义。结论pcDNA6-p70与Adeno-pp65共免疫可提高核酸疫苗的免疫效果,且具有较好的安全性。
- 王丽娜孙运芳吕锐于红曹永献刘志军张文卿
- 关键词：白细胞介素-12基因佐剂人巨细胞病毒重组腺病毒
- eglA p-Her2/neu-IL-12融合基因穿梭载体的构建被引量：5
- 2011年
- 目的:构建重组厌氧芽胞梭菌saccharobutylicum内源性β-1,4葡聚糖酶启动子(eglA p人)-表皮生长因子受体2胞外区(hHer2/neu ECD人)-白细胞介素12(rhIL-12)融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-hHer2/neu-rhIL-12融合基因修饰的厌氧芽胞梭菌,并探讨其对Her2/neu+实体肿瘤的基因治疗作用奠定基础。方法:以含有全长hHer2/neu序列的真核表达质粒(pcDNA3.1 hHer2/neu)为模板,采用PCR方法,扩增hHer2/neu ECD基因片段;将其插入重组rhIL-12真核表达质粒pcD-NA6 rhIL-12(p1)中的rhIL-12基因上游,获得pcDNA6 hHer2/neu ECD-rhIL-12(p2)真核表达质粒;设计合成eglAp基因中一段55 bp序列作为模板,通过连续PCR的方法,扩增eglAp片段(335 bp),并构建T-eglA p(p3)亚克隆质粒;通过酶切连接的方法,将eglA p片段插入p2质粒中的hHer2/neu ECD基因上游,构建pcDNA6 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12(p4)真核表达质粒;通过in-fusion技术,将融合基因eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12插入pIMP1穿梭表达质粒,构建重组pIMP1eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12(p5)穿梭表达载体,并进行菌液PCR、酶切及测序鉴定。结果:获得的hHer2/neu ECD和eglA p片段及p2、p3、p4重组质粒、p5融合基因重组穿梭表达载体,其PCR产物和酶切片段大小与预期一致,测序结果证实各基因序列与GenBank中mRNA或DNA序列一致。结论:成功地构建了大肠杆菌-厌氧芽胞梭菌融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12融合基因修饰的厌氧芽胞梭菌,探讨其对Her2/neu+实体肿瘤的基因治疗作用奠定基础。
- 刘颖张文卿于红吕锐张艳丽徐腾飞李丹
- 关键词：IL-12
