广东省自然科学基金(S2011010000764)
- 作品数：7 被引量：21H指数：3
- 相关作者：王晓红李罡李叶扬孙敬恩梁振文更多>>
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- 人增生性瘢痕中整合素连接激酶表达及与血管生成的关系被引量：8
- 2011年
- 目的探讨不同生长期人类瘢痕巾整合素连接激酶（ILK）表达及与血管生成的关系，方法（1）将笔者单位2009年12月-2010年12月收治的15例烧伤瘢痕忠背按德痕生长时间分为：小于6个月组、6～12个月组、大于12个月组．每组5例。采集各组瘢痕绀织，用免疫组织化学法观察ILK的表达分布，实时荧光定量RT—PCR法检测ILK mRNA的表达水平。（2）取小于6个月组瘢痕组织，分离培养瘢痕微血管内皮细胞（MEC），免疫磁珠法纯化后用花青类荧光染料Cy3标记的凝血因子Ⅷ进行鉴定，以人皮肤Fb为对照。取对数牛长期MEC，按随机数字表法分为3组：对照组，仪用含微m管生长添加剂的M131培养液培养；空质粒组，用空载质粒转染；ILK甄补DNA转染组，用ILK互补DNA表达质粒转染。转染24h后，实时荧光定量RT—PCR法榆测各组细胞中ILK、激胁功能区受体（KDR）、fms样酪氨酸激酶1（Flt—1）的mRNA表达情况。对数据进行单闪索方差分析．结果（1）小于6个月组瘢痕组织表皮荩底细胞、MEC及Fh胞质中均有ILK阳性表达，6～12个月组搬痕组织巾仅表皮基底细胞可见ILK阳性表达，大于12个月组瘢痕组织中ILK阳性表达不明显、（2）小于6个月组瘢痕组织中ILKmRNA表达水平（0．34±0．16）明显高于6～12个月组（0．17±0．06）及大于12个月组（0．07±0．13），F=37．007，P=0．000。（3）纯化后MEC旱铺路行样密集生长，胞质中凝血因子Ⅷ呈阳性表达；人皮肤Fb中未见凝血因子Ⅷ表达。（4）ILK瓦补DNA转染纰瘢痕MEC中ILK、KDR及FIt—1的mRNA表达水平分别为57．807±5．556、0．836±0．014、0．162±0．005，均姓著高于对照组的0．018±0．003、0．028±0．020、0．023±0．004和夺质粒组的0.042±0．005、0．039±0．007、0．046±0．003（F值分别为87．110、11．241、18．199，P值均小于0．01）。结论ILK主要表达于小于6个月的早期瘢
- 李叶扬米兰李罡林伟华孙敬恩王仁坤梁振文
- 关键词：瘢痕新生血管化病理性整合素连接激酶微血管内皮细胞
- QLT0267抑制整合素连接激酶对人皮肤成纤维细胞生物学特征的影响被引量：4
- 2013年
- 目的观察不同浓度的QLT0267抑制整合素连接激酶(ILK)的活性对成纤维细胞(Fb)生物学特征的影响。方法收集整形手术后剩余的皮肤标本,采用机械法加酶消化法分离培养Fb,随机分为空白对照组、5 nM组、10 nM组、20 nM组、30 nM组、DMSO组,其中空白对照组常规培养不做任何处理,5 nM组、10 nM组、20 nM组、30 nM组按培养基中QLT0267浓度分别为5、10、20、30 nmol/L加入QLT0267溶液[二甲基亚酮(DMSO)为溶剂],DMSO组加入与30 nM组中QLT0267溶液同体积的DMSO,分组处理12、24、48、72 h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态。CellTiter试剂盒检测分组处理24、48、72 h后各组Fb的增殖情况,并与空白对照组比较计算增殖抑制率;在48 h时间点,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况以及Western Blot法观察Fb表达磷酸化蛋白激酶B(pAKT)、总蛋白激酶B(tAKT)蛋白的变化。对数据进行LDS-t检验和重复测量设计方差分析检验。结果经浓度大于10 nmol/L的ILK特异性抑制剂作用下,Fb膨胀,细胞核固缩或破碎,并出现细胞凋亡,随QLT0267浓度的增高和刺激时间的延长,细胞形态的改变更加明显。CellTiter试剂盒检测结果显示10 nmol/L以上的QLT0267能明显抑制Fb的增殖,且随着QLT0267浓度的增高和刺激时间的延长,增殖抑制率也升高(F处理组=94.242,P<0.05;F时间=240.490,P<0.05;F处理与时间=11.551,P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示与对照组比较,10 nmol/L以上的ILK特异性抑制剂能诱导Fb凋亡,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果显示在各组tAKT的表达组间差异无统计学意义(P>0.05)的前提下,不同浓度QLT0267组pAKT的表达比空白对照组低,并随着QLT0267浓度的上升而pAKT蛋白生成下降(P<0.05)。结论 10 nmol/L浓度以上ILK特异性抑制剂QLT0267能刺激Fb发生形态改变,抑制细胞增殖和促进细胞凋亡。推测ILK可能通过影响Fb中pAKT的生成参与创面愈合过程的调控。
- 梁振文李叶扬林伟华李罡孙敬恩王仁坤王晓红
- 关键词：伤口愈合成纤维细胞整合素连接激酶
- 特异性整合素连接激酶抑制剂QLT0267对大鼠烧伤创面愈合影响的初步研究被引量：6
- 2014年
- 目的观察局部注射特异性整合素连接激酶(ILK)抑制剂QLT0267对SD大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合影响,初步探讨ILK在创面愈合过程中的作用及机制。方法选取45只雄性SD大鼠,采用恒温恒压烫伤仪在其背部皮肤制备深Ⅱ度烧伤创面,并随机分成实验组、对照组及二甲基亚砜(DMSO)组,每组15只。实验组创面每天注射浓度100μM QLT0267液100μL;对照组创面每天注射0.9%氯化钠溶液100μL;DMSO组创面每天注射0.3%DMSO液100μL。测量各组大鼠创面愈合时间和愈合率;伤后14 d取材,各组随机选择5只大鼠,用SP法检测ILK、AKT、PAKT、α-SMA在创面组织中的表达,Western Blot检测各组ILK、AKT、PAKT蛋白含量;用Masson改良法检测创面胶原。结果实验组大鼠创面平均愈合时间为(21.1±0.6)d,比对照组(17.1±0.6)d和DMSO组(17.7±0.6)d长;实验组创面愈合率也低于对照组和DMSO组,比较差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot检测结果显示:各组ILK、AKT蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05),实验组PAKT蛋白显著低于对照组和DMSO组。SP法结果各组ILK、AKT表达差异无统计学意义(P>0.05),实验组ILK活性被抑制,PAKT(0.406±0.008)表达较对照组(0.901±0.013)、DMSO组(0.966±0.011)降低,比较差异有统计学意义(F=11.27,P=0.04);实验组α-SMA表达(0.201±0.003)较对照组(0.339±0.006)、DMSO组(0.351±0.005)也降低,比较差异有统计学意义(F=52.86,P=0.001);实验组细胞外基质胶原排列较对照组、DMSO组明显稀疏、紊乱。结论 ILK活性被抑制时延迟大鼠皮肤创面愈合。ILK特异性抑制剂QLT0267通过抑制ILK活性PAKT合成减少,可能影响其下游信号的传导,导致肌成纤维细胞生成减少、胶原合成减少,影响创面愈合。
- 王晓红李叶扬李罡孙敬恩林伟华周日兴
- 关键词：整合素连接激酶伤口愈合SD大鼠
- 整合素连接激酶对含成纤维细胞胶原网格收缩的影响被引量：2
- 2011年
- 目的探讨整合素连接激酶（ILK）对含成纤维细胞胶原网格（FPCL）收缩的影响和机制。方法（1）运用人皮肤成纤维细胞（Fb）构建FPCL，观察ILK-AKT信号通路特异性抑制剂LY294002对FPCL收缩的影响。（2）运用Westernblot印迹法检测ILK小干扰RNA（siRNA）转染和LY294002对Fb中ILK和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的影响。结果第24小时和第48小时LY294002组FPCL收缩率[（20．23±9．57）％、（22．47±10．93）％]明显低于对照组[（48．73±6．60）％、（54．33±12．88）％]（P〈0．05），第72、96和120小时FPCL收缩率为（25．58±7．40）％、（26．67±13．76）％、（28．82±3．48）％明显低于对照组（58．00±7．54）％、（59．67±11．29）％、（66．95±9．98）％和DMSO组（47．34±12．41）％、（52．26±10．90）％、（56．38±10．75）％（P〈0．05）。LY294002组和ILKsiRNA转染组α-SMA蛋白表达（0．992±0．255、1．225±0．323）与各对照组（2．009±0．820、2．190±0．577、1．758±0．732）比较均显著降低（P〈0．05）。结论阻断ILK信号通路可明显抑制Fb构建的FPCL收缩和F}）中α-SMA的表达。
- 李罡李叶扬戴丽冰米兰孙敬恩王仁坤
- 关键词：整合素连接激酶创面Α-平滑肌肌动蛋白
- 整合素连接激酶对增生期瘢痕血管生成的调控作用被引量：2
- 2013年
- 目的探讨整合素连接激酶（intergrin—linked kinase，ILK）对增生性瘢痕血管生成的影响及调控机制。方法收集6例增生期的瘢痕组织标本，体外分离培养瘢痕微血管内皮细胞（HSMECs），取2—4代生长状态良好的细胞，并分成4组：空白对照组，常规细胞培养；阴性对照组，只加入Lipo2000转染试剂；LY294002组，加入终浓度50nmol／L的LY294002；ILK siRNA组，加入终浓度为20nmol／L的ILK siRNA。转染48h后，采用RT—PCR法及Western Blot法检测ILK mRNA和蛋白表达的变化。利用Transwell法，收集转染后的4组HSMECs，用不含血清的DMEM重悬，种入上层小室，下层加完全培养基，10h后终止实验，计算各组细胞迁移数，观察不同处理因素对HSMECs迁移能力的影响。将冻融的ECMatrix基质胶在冰面上均匀的铺人预冷的48孔板中，37℃温箱孵育使其凝胶，然后取转染后的4组细胞种人胶面上，8h后终止实验，依据血管形成模式评分表随机选择8个视野进行评分，分析各组细胞的体外血管形成能力。结果①与空白对照组（ILK mRNA=0．829±0．109、ILK蛋白=1）相对比，ILK siRNA组HSMECs内ILK mRNA表达水平（ILK mRNA=0．002±0．000；t=13．151，P=0．006）及蛋白表达水平（ILK蛋白=0．096±0．049；t：36．656，P=0．000）均明显受到抑制，而LY294002组ILK的表达虽略有降低，但差异无统计学意义。②ILKsiRNA组与LY294002组在10h时的细胞迁移数分别为88．111±3．079、138．667±2．404，较空白对照组322．333±3．712显著降低（P〈0．05）。③在体外血管形成8h时，ILK siRNA组（2．625±0．125）和LY294002组（3．125±0．250）与空白对照组（4．333±0．191）相比，体外血管形成受到明显的抑制，无法形成完整的复杂网络结构（P〈0．05）。结论在ILK表达下调的情况下，HSMECs的迁移能力与体外血管形成能力均受到明显抑制，推论ILK可能参与对瘢痕血�
- 王仁坤李叶扬李罡林伟华孙敬恩梁振文王晓红
- 关键词：整合素连接激酶瘢痕内皮细胞细胞运动
- 整合素连接激酶在瘢痕转化生长因子-β1/Smad3信号通路中的作用被引量：2
- 2014年
- 目的 观察整合素连接激酶（ILK）在转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smad3信号通路中的作用,探讨ILK对瘢痕成纤维细胞分化影响的作用机制.方法 体外分离培养瘢痕成纤维细胞后,实验分为4组：对照组、ILK小分子干扰RNA（siRNA）组、TGF-β1组、ILK siRNA＋TGF-β1组.采用荧光标记的免疫细胞化学法检测各组成纤维细胞中ILK的表达变化,应用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测各组成纤维细胞中ILK mRNA、Smad3 mRNA及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA） mRNA的表达.结果 免疫荧光图像显示,经siRNA沉默后,成纤维细胞的ILK表达水平下调;经TGF-β1（5μg/L）刺激后,ILK表达水平明显上调.FQ-PCR检测结果显示：经ILK siRNA转染后,成纤维细胞的ILK mRNA（0.522±0.113）、Smad3 mRNA （0.222±0.089）及α-SMA mRNA（0.118±0.080）表达水平同时下降;应用TGF-β1刺激后,成纤维细胞的ILK mRNA （2.233±0.511）、Smad3 mRNA（2.891±0.475）及α-SMA mRNA（2.581 ±0.826）表达水平重新上升,与对照组及ILK siRNA组比较差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 在瘢痕成纤维细胞中,Smad3及α-SMA的mRNA水平可以被ILK上调,而TGF-β1又可以诱导ILK的表达,ILK可能参与Smad蛋白的调控,对TGF-β1/Smad3信号通路诱导的促成纤维细胞分化作用产生影响.
- 林伟华李叶扬米兰李罡孙敬恩王仁坤
- 关键词：整合素连接激酶增生性瘢痕成纤维细胞转化生长因子-Β1
- 二氯化钴化学缺氧诱导瘢痕成纤维细胞整合素连接激酶的表达及其对细胞增殖的影Ⅱ向被引量：2
- 2013年
- 目的探讨二氯化铺（CoCL）化学缺氧对瘢痕Fli整合素连接激酶（1LK）表达的影响，以及其对细胞增殖的影响。方法体外培养7例患肯增生性瘢痕FL，取第5～6代细胞进行实验。7例患者的Fh各取6瓶，分别加入含6种终浓度为0、50、100、150、200、250txnlol／LCoCl，的DMEM培养液培养24h，采用实时荧光定量PCR法检测ILKmRNA表达。选择最适CoCl，浓度（100μmol／L）进行缺氧刺激，观察ILK蛋白于CoCI，作用0、1、2、4、12、24h的表达。将细胞分为正常对照组、阴性对照组、ILK小f扰RNA（siRNA）组，分别将con—siRNA及ILKsiRNA转染入后2组细胞，对照组仅以培养液培养，24h后弃堵养液，置于含6种浓度CoCI，的培养液中培养24h。各组各浓度4个复孑L。采剧3，3’-[1-（苯氨酰摹）-3，4-四氮唑]．二（4．甲氧基-6-硝基）苯磺酸钠（XTT）法检测各组细胞增殖水平。埘数据进行单因素方差分析以及重复测量方差分析，多重比较采用LSD法。结果100Ixmol／LCoCI，作用24h时ILKmRNA表达最高，与其他浓度CoCI，作用的Fl】相比差异有统计学意义（F=50．958，P〈0．001）。100μmol／LCoCl，作用时蛋白表达量（0．243±0．009）较0h（0．387±0．017）降低，2h（0．36l±0．010）开始增高，4h（0．584±0．028）、12h（0．730±0．029）、24h（0．785±0．031）ILK蛋白表达强度逐渐增强。其1、4、12、24h的ILK篮白表达艟与0h牛日比差异具有统计学意义（P值均小于0．05）。结果显示，正常对组在100μmol／I。CoCI2作用时细胞增殖水平最高（F=488．026，P〈0．001），从150μmol／I．起细胞增殖水平开始下降，250μmol／1．时细胞增殖水平显格低于0-μmol／[时水平（P值均小于0．05）。ILKsiRNA组细胞增殖水平在各浓度CoCI，作用下无明显变化（F=2．542，P=0.056）。ILKsiRNA纰的细胞增殖水平显著低于正常对照组及阴性对照组（F=2519．542，P〈0．
- 李叶扬李罡米兰林伟华孙敬恩汪锦伦梁振文王晓红
- 关键词：缺氧成纤维细胞整合素连接激酶增生性瘢痕
