国家自然科学基金(30671964)
- 作品数：10 被引量：16H指数：2
- 相关作者：李明远蒋忠华李婉宜王保宁张强更多>>
- 相关机构：四川大学遂宁市第一人民医院新疆医科大学第一附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 小鼠β防御素1与甲型流感病毒M2e融合基因表达及其免疫特性研究
- 2010年
- 目的构建mBD1与M2e融合基因的真核表达载体,并检测其在MDCK细胞中的表达情况,初步探讨其免疫特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD1与M2e基因片段,再通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)将mBD1与M2e通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD1-M2e。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)获得重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-M2e,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光、RT-PCR产物序列分析检测融合蛋白表达情况,最后采用MTT法检测mBD1-M2e融合蛋白刺激淋巴细胞增殖能力。结果经鉴定后证实构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-M2e正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,该细胞培养上清液能刺激淋巴细胞增殖。结论本研究成功构建mBD1-M2e融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,这一结果为进一步研究新型高效通用的流感病毒核酸疫苗奠定了坚实的基础。
- 张强丰锋左斌巩天祥李婉宜王保宁李明远
- 关键词：甲型流感病毒Β防御素融合基因重叠延伸PCR免疫荧光
- 小鼠β防御素2、3融合基因载体构建及其抗流感病毒作用被引量：2
- 2010年
- 目的构建mBD2与mBD3融合基因的真核表达载体,检测其在MDCK细胞中的表达情况,并探讨其抗病毒特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD2与mBD3基因片段,通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)将mBD2与mBD3通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD2与mBD3。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)获得重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-mBD3,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光检测融合蛋白表达情况,最后采用CCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果经鉴定后证实,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-mBD3正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,CCID50实验结果说明有较好的抗流感活性。结论本研究成功构建mBD2-mBD3融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,该结果为进一步研究防御素抗病毒机制奠定了坚实的基础。
- 张强李明远丰锋巩天祥李婉宜刘冯欢冯艳邝玉王保宁
- 关键词：Β防御素甲型流感病毒融合基因重叠延伸PCR免疫荧光
- 小鼠β-防御素6与甲型流感病毒M2e基因融合表达及其免疫特性研究
- 2010年
- 目的构建小鼠β-防御素6(mBD6)与甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区(M2e)真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。方法通过重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将M2e与mBD6通过一段多肽接头Gly4Ser融合成为mBD6-M2e。将其插入载体pcDNA3.1(+),构建成pcDNA3.1(+)/mBD6-M2e。鉴定正确后,转染MDCK细胞,免疫荧光、MTT检测mBD6-M2e表达和分泌。免疫小鼠,半定量PCR检测脾细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、CCR7表达。结果融合基因mBD6-M2e真核表达载体pcDNA3.1(+)/mBD6-M2e构建成功,在MDCK细胞膜上成功表达融和蛋白,转染细胞的培养上清刺激淋巴细胞增殖。免疫小鼠细胞因子表达改变。结论融合基因mBD6-M2e真核表达载体成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。
- 冯伟李婉宜李明远张强巩天祥刘冯欢罗俊邝玉王保宁蒋忠华
- 关键词：甲型流感病毒
- 小鼠β防御素2在MDCK细胞中的表达和抗流感病毒活性研究
- 2011年
- 目的探索小鼠β防御素2(mouseβ-defensin 2,mBD2)表达载体在狗肾传代细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)中的表达和抗甲型流感病毒(influenza Avirus,IAV)活性。方法将真核表达载体pcDNA3.1/mBD2利用脂质体法转染MDCK细胞,G418筛选得到稳定转染的阳性细胞,用RT-PCR方法鉴定目的基因和免疫荧光法鉴定目的蛋白在转染细胞中的表达。用TCID50测定转染细胞的抗IAV活性。用pcDNA3.1/mBD2质粒免疫小鼠,观察死亡保护率。结果 pcDNA3.1/mBD2转染MDCK细胞后在细胞中稳定表达,转染细胞的TCID50比对照组的病毒效价降低近77.98倍;重组质粒免疫小鼠后,死亡保护率为55.55%。结论 mBD2能够在MDCK细胞中稳定表达,并且在体外及体内实验中显示出抗流感病毒活性,该结果为抗流感病毒制剂研究奠定了实验基础。
- 巩天祥冯伟李婉宜张强戴军裴德翠蒋忠华李明远
- 关键词：甲型流感病毒
- 鼠β-防御素2(mBD2)真核表达质粒的构建及稳定表达株的鉴定被引量：8
- 2007年
- 目的:对小鼠β防御素-2(mBD2)基因进行克隆,构建其真核表达载体,筛选出稳定表达细胞株,并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法:通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素(LPS),建立小鼠急性时相反应,取其肺组织提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增小鼠mBD2基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1(+)真核表达载体,对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2转染SiHa细胞,采用G418进行稳定表达株的筛选,用免疫荧光染色和RT-PCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果:提取小鼠肺组织总RNA,采用RT-PCR方法扩增了250bp左右的产物,通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2。SiHa被该质粒转染后,在100mg/LG418浓度下筛选20d,得到了稳定表达mBD2的细胞株,用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达,RT-PCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论:成功地构建了pcDNA3.1(+)/mBD2真核表达质粒,mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达,这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。
- 魏晓丽施桥发李虹李婉宜蒋忠华李明远
- 关键词：真核表达免疫荧光RT-PCR
- 信号肽重组mBD2在宫颈癌细胞中的稳定表达及活性测定被引量：3
- 2007年
- 目的探讨鼠重组beta防御素2(rmBD2)对SiHa细胞增殖的影响。方法采用脂质体转染法将真核表达质粒pcDNA3.1(+)/rmBD2转染SiHa细胞系,G418筛选出稳定表达细胞克隆。分别采用间接免疫荧光染色、RT-PCR方法检测稳定转染细胞中rmBD2蛋白和rmBD2 mRNA表达,并采用MTT法对稳定转染细胞株进行细胞增殖能力的测定。结果采用100μg/mL的G418浓度筛选质粒转染的SiHa细胞20d,得到了rmBD2稳定表达细胞株SiHa/rmBD2及转染pcDNA3.1(+)空质粒的对照细胞SiHa/K。免疫荧光染色显示SiHa/rmBD2细胞质中均有目的蛋白的表达,转染效率为100%。提取稳定转染4、6、8、10周SiHa/rmBD2细胞总RNA,RT-PCR反应扩增得到220bp左右的目的片段,而SiHa/K及SiHa细胞未见目的蛋白表达。细胞生长曲线显示SiHa/rmBD2细胞的生长速度低于SiHa/K及SiHa细胞(P<0.05)。结论本研究成功筛选了稳定表达rmBD2的细胞株SiHa/rmBD2,并采用间接免疫荧光染色、RT-PCR证实了rmBD2蛋白和rmBD2 mRNA的稳定表达,细胞增殖实验表明rmBD2可以明显抑制肿瘤细胞的增殖,为进一步研究rmBD2的抗肿瘤作用奠定了细胞学基础。
- 魏晓丽李明远李虹施桥发李婉宜蒋忠华
- 关键词：免疫荧光RT-PCR细胞生长曲线
- 鼠β-防御素2抗宫颈癌的实验研究被引量：2
- 2009年
- 目的:建立BALB/c小鼠U14宫颈癌移植瘤模型,观察肿瘤生长情况,探讨mBD2对小鼠机体免疫功能的影响。方法:采用无内毒素质粒大抽试剂盒抽提pcDNA3.1(+)/mBD2、pcDNA3.1(+)/rmBD2和pcDNA3.1(+)质粒DNA。将荷瘤小鼠随机分为5组,分别采用pcDNA3.1(+)/mBD2、pcDNA3.1(+)/rmBD2质粒治疗,同时设立pcDNA3.1(+)、顺铂和PBS组对照;观察肿瘤生长状况、荷瘤小鼠存活时间,绘制小鼠生存曲线。结果:成功建立了BALB/c小鼠U14移植瘤模型。采用pcDNA3.1(+)/mBD2、pcDNA3.1(+)/rmBD2、pcDNA3.1(+)治疗造模成功的荷瘤小鼠,结果显示:pcDNA组及PBS组肿瘤生长迅速,出现大范围出血、坏死,并于治疗后7d全部死亡;mBD2组与rmBD2组小鼠肿瘤生长相对缓慢,出现局部出血坏死等现象,至治疗2周,出现死亡,至治疗结束时,每组仍有3只小鼠存活,而Pt组小鼠肿瘤生长慢,小鼠生长较为活跃,至治疗21d,开始出现死亡,pcDNA和PBS组与mBD2组和rmBD2组及Pt组与mBD2组和rmBD2组生存时间比较,结果有统计学意义(P<0.05),mBD2组和rmBD2生存时间比较,也具有统计学意义(P<0.05)。结论:mBD2能够抑制移植瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间。在抑瘤效果上,mBD2优于外加信号肽重组mBD2作用。
- 魏晓丽丁剑冰蒋忠华温浩李明远
- 关键词：U14宫颈肿瘤
- mBD1-mBD3融合基因真核表达载体构建及体外抗流感病毒初步研究
- 2009年
- 目的构建小鼠β-防御素1和β-防御素3(mBD1,mBD3)融合基因的真核表达载体,研究mBD1-mBD3融合蛋白的抗流感病毒作用。方法通过RT-PCR和重建PCR方法构建mBD1-mBD3融合基因;经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-mBD3,对重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定;将构建好的真核表达载体转染MDCK细胞,G418筛选稳定表达株,RT-PCR和免疫荧光染色法鉴定胞内mBD1-mBD3的表达。用流感病毒感染稳定表达细胞株,TCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果成功克隆到mBD1-mBD3基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/mBD1-mBD3。RT-PCR和间接免疫荧光证实重组质粒可以在细胞内表达。实验组的TCID50显著高于对照组,初步显示出mBD1-mBD3的抗流感病毒作用。结论本研究成功构建了pcDNA3.1(+)/mBD1-mBD3真核表达载体,且能在MDCK细胞中稳定表达,表达产物具有一定的抗流感病毒作用。为进一步深入研究mBD1-mBD3的生物学特性及其抗流感病毒作用机制奠定了基础。
- 冯艳王月玲李明远江滟李婉宜杨远王保宁冯伟张强蒋忠华
- 关键词：真核表达免疫荧光TCID50
- 小鼠β防御素3在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌作用的初步研究被引量：2
- 2009年
- 目的构建小鼠β防御素3(mouseβdefensin3,mBD3)基因的原核表达载体pET-32a(+)/mBD3,诱导mBD3融合蛋白在大肠杆菌中的表达,并融合蛋白的抗菌活性。方法运用PCR技术从质粒pcDNA3.1(+)/mBD3中扩增mBD3基因片段,将该片段插入pET-32a(+)原核表达载体,并对构建的重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta-gami(2),用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE和Western Blot鉴定融合蛋白。通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,用微量液体稀释法测定融合蛋白鼠β防御素3(f mBD3)的抗菌活性。结果mBD3的原核表达载体pET-32a(+)/mBD3构建成功,在大肠杆菌中表达出fmBD3并提取获得纯化的融合蛋白。fmBD3对单细胞真菌具有较好的抑制和杀灭作用,可抑制革兰阳性菌的生长,而对革兰阴性菌无作用。结论构建的原核表达载体在大肠杆菌中成功表达fmBD3,该融合蛋白显示出较强的杀真菌作用和一定的抗细菌作用,为进一步研究鼠防御素的抗微生物活性奠定了实验基础。
- 江滟王保宁杨晓芳李婉宜刘冯欢蒋忠华李明远
- 关键词：原核表达融合蛋白抗菌作用
- 小鼠β-防御素2与甲型流感病毒HA1融合基因真核载体的构建与表达被引量：2
- 2008年
- 目的:构建小鼠β-防御素2(mBD2)与甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)血凝素(HA1)基因融合表达的真核载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:用PCR技术分别从质粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中扩增mBD2与HA1基因片段,再用重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将HA1与mBD2通过一段多肽接头Gly4Ser融合为mBD2-HA1。将mBD2-HA1融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切、PCR和测序鉴定正确后,用脂质体转入HEK293细胞,通过免疫荧光检测其瞬时表达。结果:融合基因mBD2-HA1的真核表达载体pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1构建成功,并在HEK293细胞中成功表达融和蛋白。结论:融合基因mBD2-HA1真核表达载体的成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。
- 朱元军张卫东李虹王丰平钟利蒋忠华李明远
- 关键词：Β-防御素流感病毒融合基因重叠延伸PCR
