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人脐静脉内皮细胞饲养层促进胚胎干细胞的生长: 2008年; 目的探讨人脐静脉内皮细胞是否可作为饲养层支持胚胎干细胞（ESCs）的生长。方法分离培养人脐带内皮细胞，采用生长良好的3代内皮细胞，灭活后制备饲养层，通过观察碱性磷酸酶染色、胚胎干细胞特异性表面标志物检测、染色体核型分析和严重联合免疫缺陷小鼠（SCID）体内畸胎瘤形成实验，对在内皮细胞上的E14．1胚胎干细胞进行鉴定。结果E14．1胚胎干细胞在人脐静脉内皮细胞上传3～8代后细胞呈克隆性生长，高度表达碱性磷酸酶、SSEA-1及Oct-4。传15代后仍表现正常的二倍体核型。传20代的ESCs接种到SCID小鼠，6周后均能形成畸胎瘤。结论人脐静脉血管内皮细胞能有效地支持ESCs的生长，解决了ESCs临床应用的生物安全性问题。; 王志华何志旭米蔷汪浩文; 关键词：胚胎干细胞脐静脉内皮细胞饲养层

人成纤维细胞饲养层的制备及其对胚胎干细胞生长支持作用被引量：2: 2008年; 目的为建立不含动物细胞成分的人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESc)体外培养系统,用人包皮成纤维细胞(human postnatal foreskin fibroblasts,hPFF)制备细胞饲养层并观察其对hESc体外生长的支持功能及生物学特性的维持作用。方法利用儿童阴茎包皮环切术后遗弃包皮组织分离培养成纤维细胞,纯化增殖细胞,采用35Gyγ射线照射灭活法制备成饲养层。将hESc(HS181细胞株)接种在该饲养层上,连续传代至20代,倒置显微镜观察其形态学变化,测定其细胞碱性磷酸酶活性,类胚体形成实验及干细胞转录因子表达,严重联合免疫缺陷的小鼠(severe combined immune deficiency mice,SCID)体内畸胎瘤形成及体内全能分化特性实验对hESc生物学特性进行鉴定。结果hPFF体外培养过程中生长增殖旺盛,连续传20代以上能保持正常细胞形态学和生物学特性。经γ射线照射使其停止增殖,24 h内能较好地保持细胞活力和形态学特征,具备饲养层细胞基本条件。HS181 hESc在hPFF上传到20代仍能较好地保持未分化状态,细胞呈克隆性生长,高度表达碱性磷酸酶及Oct-4、Nanog等胚胎干细胞转录因子;悬浮法培养连续传20代的hESc可获得由3个胚层细胞所形成的类胚体(Embryoid bodies,EB)结构,可检测到CD90、Flt-1、Nestin基因的表达,证明得到的类胚体中含了3个胚层细胞,说明hESc具有体外多能干性特征。体内全能分化实验显示:将第20代的hESc接种到SCID小鼠体内,6周后可形成畸胎瘤,组织学切片分析其包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞,直接证明其具有体内多向分化的全能性。结论hPFF可作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞,能有效地支持hESc体外生长。克服了目前hESc建系和体外培养过程中使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险,初步解决了hESc临床应用的生物安全性问题。; 米蔷何志旭段茂利王志华杨燕; 关键词：胚胎干细胞成纤维细胞饲养层

体外分化胚胎干细胞为造血干细胞重建造血功能的研究被引量：4: 2008年; 目的:探讨体外定向分化胚胎干细胞(ESCs)为造血干细胞(HSCs)对体内造血功能的重建作用。方法:将小鼠E14.1胚胎干细胞采用"三步诱导法"在体外分化发育为HSCs,造血克隆形成(CFU)实验观察其体外造血集落形成情况,免疫磁珠分选纯化HSCs移植给经亚致死剂量γ射线照射的雌性SCID小鼠,观察其植入及小鼠造血功能恢复情况。结果:经过分阶段诱导,多种造血刺激因子联合应用能有效促进ESCs定向分化发育为HSCs,流式细胞仪检测HSCs特异性表面标志物CD34+/Sca-1+表达最高为(58.64±4.20)%,CFU培养能形成较多的红系、粒系/巨噬细胞系及混合细胞集落,Wright-Giemsa染色显示为原始的造血细胞。此阶段的HSCs经分选纯化后移植给经γ射线照射后的小鼠,移植组小鼠+10d造血功能开始恢复,观察40d后除血小板恢复较慢外,白细胞、红细胞、血红蛋白等指标已接近正常,植入率为71.4%,存活率为43.0%,染色体检测证实已由受体鼠的XX转为供体鼠的XY。结论:采用分阶段诱导的方法,可在体外定向诱导小鼠ESCs分化发育为HSCs,此来源的HSCs可以有效重建体内造血功能。; 何志旭林槟黄绍良米蔷黄景; 关键词：胚胎干细胞造血干细胞细胞移植

胚胎干细胞诱导分化为造血干细胞重建造血功能的研究被引量：1: 2008年; 使用胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）诱导分化为造血干细胞（hematopoietiestem cells，HSC）解决移植供体来源匮乏是目前国际上研究的热点问题。我们使用小鼠ESC体外定向诱导分化为HSC，并移植给骨髓摧毁模型小鼠，观察重建体内造血的情况，借以评价其功能性。; 何志旭黄绍良林槟米蔷黄暻; 关键词：细胞诱导分化造血功能体外定向诱导分化模型小鼠供体来源

人脐静脉血管内皮细胞饲养层的制备: 2008年; 目的探讨使用人脐静脉内皮细胞制备饲养层的方法。方法使用健康产妇剖宫产后同意遗弃的脐带,无菌状态下胶原酶消化法收集内皮细胞,进行传代培养和增殖扩增,免疫组化法进行Ⅷ因子相关抗原鉴定,分别取 P2～P5代内皮细胞经丝裂霉素 C(10μg/ml)分别处理30、60、90、120 min 后再接种 E14.1胚胎干细胞。观察 E14.1胚胎干细胞在内皮细胞上的生长情况。结果经丝裂霉素 C 处理30～60 min 后的 P2～P3代内皮细胞可以很好的支持胚胎干细胞的生长。结论人脐静脉血管内皮细胞可作为一种来源丰富、取材方便的人源化饲养层细胞,为以后临床应用打下基础。 [临床儿科杂志,2008,26(10):890-892]; 王志华何志旭汪浩文米蔷; 关键词：人脐静脉内皮细胞饲养层

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国际科技合作与交流专项项目(2004DFA03400)

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