国家自然科学基金(81070054)
- 作品数：8 被引量：19H指数：3
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- 小窝蛋白-1的生物学功能及其急性肺损伤被引量：2
- 2011年
- 概述
一、小窝小窝最早是由Palade于1953年在电镜下观察内皮细胞时发现,当时称之为＂质膜囊泡＂,而＂小窝＂一词是由Yamada在1955年提出,描述胆囊上皮细胞上＂与细胞外相交流的小口袋、囊泡、洞穴或凹陷＂。随后,在其他多种细胞上也发现类似结构,其直径为50～100 nm,呈烧瓶形或Ω形,
- 高磊孙耕耘
- 关键词：小窝蛋白-1急性肺损伤生物学功能镜下观察细胞外种细胞
- 靶向大鼠Caveolin-1基因的短发夹RNA表达载体的构建
- 2012年
- 目的构建靶向大鼠caveolin-1基因的shRNA表达载体。方法化学合成靶向caveolin-1的单核苷酸链,经退火成双链。将退火得到的双链DNA克隆至表达载体pLL3.7中得到重组质粒,经限制性内切酶酶切、DNA测序进行鉴定。结果通过限制性内切酶酶切、DNA测序证实,成功构建大鼠pLL3.7-cav-1表达载体。结论成功构建了靶向大鼠caveolin-1的shRNA表达载体,为以后进行caveolin-1与ALI/ARDS的相关研究奠定了基础。
- 岳扬孙耕耘尤青海王楠邵敏张丹
- 关键词：短发夹RNA小窝蛋白-1
- 肿瘤坏死因子α对大鼠肺微血管内皮细胞表达白细胞介素17受体C的影响被引量：4
- 2013年
- 目的观察肿瘤坏死因子a（TNF—a）对大鼠肺微血管内皮细胞表达白细胞介素17受体C（IL-17RC）的影响及甲泼尼龙的干预作用。方法体外培养肺微血管内皮细胞，根据TNF-a刺激浓度和时间的差异，将肺微血管内皮细胞分为TNF-a量效组和时效组：前者以0、0．1、1、10μg/LTNF—a与肺微血管内皮细胞孵育3h；后者以10μg／LTNF—a分别与肺微血管内皮细胞孵育0、1、3、6、12h。药物干预：分别以10μg／L的TNF．仅和200μg/L甲泼尼龙＋10μg／L的TNF-a与肺微血管内皮细胞孵育3h。用反转录-PCR，Western印迹及免疫细胞化学染色法检测IL-17RC表达。反转录-PCR检测TNF-a和甲泼尼龙对肺微血管内皮细胞表达IL-17RCmRNA的影响。结果反转录．PCR和Western印迹均证实肺微血管内皮细胞表达IL-17RC，免疫细胞化学染色发现IL-17RC主要分布在肺微血管内皮细胞胞膜和胞质。量效组IL-17RCmRNA相对表达量随TNF—a浓度（0、0．1、1、10μg／L）增加逐渐升高，分别为：0．241±0．010和0．372±0．017、0．452±0．017、0．643±0．042（F=46．460，P〈O．05）。时效组IL-17RCmRNA相对表达量于lh开始上升（0．417±0．038），3h达峰值（0．674±0．018），之后渐下降（6h：0．378±0．035，12h：0．318±0．032），但均高于孵育0h组（0．197±0．008），各时相组间比较差异均有统计学意义（F=37．903，P〈0．05）。甲泼尼龙显著下调TNF．仪诱导IL-17RCmRNA过度表达（0．333±0．031比0．660±0．026，F=89．637，P〈0．05）。结论IL-17RC主要分布在肺微血管内皮细胞胞膜和胞质；TNF-a刺激诱导肺微血管内皮细胞过度表达IL．17RC；甲泼尼龙抑制TNF—a对肺微血管内皮细胞表达IL-17RC的诱导效应，从而减轻肺微血管内皮细胞的炎症反应。
- 尤青海张丹孙耕耘岳扬王楠
- 关键词：受体白细胞介素17内皮细胞
- 大鼠肺微血管内皮细胞通透系数检测的方法被引量：7
- 2011年
- 目的探讨肺微血管内皮细胞（PMVEc）通透系数检测的实验方法。方法分别在transwell小室和聚碳酸酯纤维膜上构建大鼠PMVEC单层模型，用电阻抗仪和倒置显微镜观察到细胞单层汇合后，分别应用电阻抗仪监测跨内皮细胞电阻（TER），用异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖法检测通透系数（Pd），用Hanks平衡液法检测通透系数（助）；同时观察脂多糖（LPS）刺激0．5h和2h后的PMVEC通透性变化，以测量值与其相应静息状态值的比值表示。结果倒置显微镜下观察到细胞接种后3d时已汇合成单层时TER值为（39．45±3．96）Q·cm2，Pd值为（8．52±0．50）×10cm／s；随细胞接种时间增加，TER值稳定升高，接种后4d达高峰[（49．84±3．93）Q·cm2]。静息状态下汇合成PMVEC单层的TER值、Pd值和却值分别为（49．84±3．93）Ω·cm2、（6．15±0．63）×10-6cm／s和（6．80±0．62）×10^-7cm·s-1·cm H2O-1。与未刺激组比较，10mg／LLPS刺激PMVEC0．5h和2h后，TER法测定的通透性均下降（0．87±0．03、0．45±0．04比1．OO±0．08），Pd法和功法测定的通透性均增加（Pd：1．33±0．11、2．43±0．14比1．00±0.10；Lp：1．30±0．07、2．38±0．15比1．00±0．11），差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论TER法、Pd法和坳法均能有效检测PMVEC通透系数，倒置显微镜联合TER和Pd法所测值更加精确，从而为体外研究急性肺损伤发病机制提供实验方法。
- 尤青海高磊岳扬孙耕耘
- 关键词：肺微血管内皮细胞通透性TRANSWELL电阻抗
- 小窝蛋白-1在肺部炎症反应中的研究进展
- 2011年
- 小窝是一种特化的细胞膜结构，主要南蛋白质和脂类组成，小窝蛋白是其主要的结构蛋白。在肺部炎症反应中，小窝富集多种信号分子，成为信号转导的枢纽。小窝蛋白-1能够调节中性粒细胞的活化及其对内皮细胞的黏附，参与调节多种信号分子如G蛋白、蛋白激酶C、核转录因子κB的活性，因而存肺部炎症反应过程中具有重要的作用。
- 岳扬孙耕耘
- 关键词：小窝小窝蛋白炎症反应信号转导
- src抑制的蛋白激酶C底物调控内皮细胞分泌TNF-α被引量：3
- 2012年
- 目的探讨8re抑制的蛋白激酶c底物（SSeCKS）对脂多糖（LPS）诱导大鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）分泌肿瘤坏死因子（TNF）-α的影响。方法体外培养Wistar大鼠PMVEC，按随机数字表法分组（n=4），10mg／LLPS刺激1h、3h、6h、12h、24h或0．1mg／L、1mg／L、10mg／LLPS刺激24h；蛋白激酶C抑制剂（BIM）预处理0．5h或50nmol／LSSeCKS-siRNA转染PMVEC48h后再加入10mg／LLPS孵育24h，酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清TNF-α
量（ng／L）。采用SPSSl0．0软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，以P〈0．05为差异具有统计学意义。结果0．1、1、10mg／LLPS刺激PMVEC24h后的，TNF-α分泌量分别为（253．70±23．55）、（327．88±37．25）、（403．204-36．22）ng／L，均高于未刺激组（82．28±22．56）ng／L（均P=0．000）；10mg／LLPS刺激PMVEC后，TNF-α分泌量于1h升高（170．11±49．22）ng／L，6h达峰值（404．82±13．78）ng／L，刺激24h后仍维持高水平（395．67±36．23）ng／L，分别与未刺激组（84．60±23．61）ng／L比较：P=0．001，0．000，0．000；BIM预处理PMVEC后再给予LPS刺激，TNF-α分泌量（200．44±27．39）ng／L较LPS单独刺激（402．28±31．07）ng／L显著较少（P=0．000）；与LPS单独刺激比较（407．28±32．64）ng／L，SSeCKS-siRNA抑制SSeCKS表达后，LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应（195．20±13．28）ng／L也显著下降（P=0．000）。结论下调SSeCKS表达和蛋白激酶C活性可抑制LPS对PMVEC分泌TNF-α的诱导效应，从而减轻PMVEC的炎症反应。
- 尤青海孙耕耘高磊岳扬张丹
- 关键词：脂多糖肺微血管内皮细胞肿瘤坏死因子小分子干扰RNA
- 小窝蛋白-1在脂多糖致肺微血管内皮细胞炎性损伤中的作用探讨被引量：4
- 2013年
- 目的探讨脂多糖（LPS）所致大鼠肺微血管内皮细胞（RPMVEC）炎性损伤中小窝蛋白-1（Cav-1）的作用机制。方法将体外培养的RPMVEC，分别进行LPS刺激时效实验和蛋白激酶A（PKA）通路干预实验。①时效实验：以10μg／mL LPS分别刺激0、1、3、6、12、24h后进行细胞单层通透性（伊文思蓝-白蛋白法）和Cav-1蛋白表达[蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）]检测；并于LPS刺激0、10、30、60、90、120min检测细胞磷酸化小窝蛋白-1（p-Cav-1）表达（Western blotting）。②干预实验：以10μmol／L蛋白激酶A特异抑制剂（PKI）与RPMVEC预孵育30min后再加入10μg／mL LPS继续孵育，30min后检测p-Cav-1表达。3h后检测细胞单层通透性及Cav-1蛋白表达；设未刺激组和LPS或PKI单独刺激组为对照。结果①LPS刺激RPMVEC后1h Cav-1蛋白表达（积分A值）即开始上升（2．97±0．07），3h达峰值（3．77±0．37），之后逐渐下降，但至24h时（1．45±0．18）仍明显高于LPS刺激0h时（1．12±0．08），组间比较差异有统计学意义（F=178．047，P=0．000）；LPS可呈时问依赖性（0、1、3、6、12、24h）增加RPMVEC通透性（A值），变化趋势与Cav-1蛋白表达-致，分别为（99．67±4.32）％、（118．17±2．32）％、（159．00±2．61）％、（141．17±2．64）％、（120．17±2．79）％、（108．83±2．04）％，组间比较差异有统计学意义（F=345．869，P=0．000）。LPS亦可呈时间依赖性增加Car-1磷酸化：10min时P—Car-1蛋白表达（积分A值）即开始升高（2．41±0．11），30min达高峰（2．83±0．10），然后逐渐下降，120min时（1．04±0．04）恢复到基础水平（1．03±0．04），组间比较差异有统计学意义（F=519．417，P=O．000）。~PKI与LPS预孵育可使Cav-1表达（积分A值：5．07±0．22比3．81±0．23，P〈0．01）及p-Cav-1表达（积分A值：3．93±0．23比2．77±0．10，P〈0．01）较LP
- 尤青海张丹孙耕耘岳扬徐秀娟
- 关键词：小窝蛋白-1脂多糖肺微血管内皮细胞蛋白激酶A
- Caveolin-1在脂多糖致大鼠肺微血管内皮细胞损伤中作用的初探
- 2011年
- 目的观察脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）对大鼠肺微血管内皮细胞（rat pulmonary microvascular endothelial cell，RPMVEC）小窝蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）表达的影响。方法体外培养RPMVEC，分别采用WI、PCR、原位杂交及免疫荧光检测Cav-1mRNA及蛋白的表达，原位杂交检测LPS和蛋白激酶C（PKC）抑制剂双吲哚基顺丁烯二酰亚胺（bis—indolylmaleimide，BIM）对Cav-ltuRNA表达的影响。结果RT—PCR和原位杂交同步检测出RPMVEC表达Cav-1基因；免疫荧光检测出RPMVEc表达Cav-1蛋白；LPS以浓度依赖方式诱导Cav-1mRNA表达增加：0．1、1、10mg／L LPS分别孵育RPMVEC6h后，Cav-1mRNA表达量随其浓度增加逐渐升高，与正常组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；10mg／L LPS刺激RPMVEC不同时间（1h、2h、3h、6h）后，RPMVEC中Cav-1mRNA表达水平呈动态变化：1h开始上升，2h达峰值，之后逐渐下降，但至6h仍高于正常水平（P〈O．05）；10μmol／LBIM预孵育RPMVEClh后，可显著下调10mg／L LPS对Cav-1mRNA表达的诱导效应（P〈0．05）。结论RPMVEC表达Cav-1，LPS上调RPMVECCav-1基因转录，PKC信号通路参与LPS对RPMVECCav-1基因转录的调控。
- 高磊孙耕耘尤青海王楠岳扬张丹
- 关键词：血管内皮细胞小窝蛋白-1脂多糖蛋白激酶C
