山东省自然科学基金(E99C02)
- 作品数：14 被引量：30H指数：4
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- 相关机构：青岛大学青岛大学医学院附属医院青岛市市立医院更多>>
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 基因变构人白细胞介素-2克隆构建和原核表达被引量：2
- 2005年
- 目的构建基因变构IL-2穴88N→R雪的重组克隆熏并将其在原核系统中进行高效表达,为研究基因变构IL-2穴88N→R雪的生物学活性奠定基础。方法分离人体T细胞经PHA刺激活化后,提取细胞的RNA为模板,逆转录构建cDNA文库,经套式PCR扩增出编码IL-2的基因,插入T-A载体后获得编码天然IL-2的克隆,核苷酸测序证实成功后,自行设计含有突变位点的引物,利用重组PCR技术,进行定点诱变构建基因变构IL-2穴88N→R雪的重组克隆熏DNA测序确认变构成功。将改构后的IL-2基因重组于原核pGEX-4T-2质粒上,转化宿主菌E.coli.DH5α中,经IPTG诱导后表达IL-2变构体,表达产物经SDS-PAGE电泳分析。结果获得了人类天然IL-2的编码基因克隆和基因变构IL-2的编码基因克隆,并将变构IL-2穴88N→R雪在大肠杆菌中获得了高效表达。结论IL-2基因的成功定点变构及其在原核生物中获得稳定高效的表达,为进一步在真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型基因变构IL-2药物奠定基础。
- 郑长青王斌冯国基钱冬萌
- 关键词：白细胞介素-2原核表达DNA
- 重组蜂毒素-基因变构IL-2的纯化与生物活性被引量：5
- 2006年
- 目的制备纯化重组蜂毒素-基因变构IL-2(Melittin-88ArgIL-2)嵌合蛋白,并检测其生物活性。方法将含表达载体的大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达。表达产物经离子交换层析与亲和层析进行纯化,SDS-PAGE鉴定,MTT染色法检测嵌合蛋白对Hela细胞增殖的抑制作用。结果所表达的可溶性蛋白,纯化后纯度达95%,蛋白浓度0.5g/L。纯化后的嵌合蛋白在体外能抑制Hela细胞的增殖。结论已成功地制备并纯化了重组melittin-88ArgIL-2嵌合蛋白,该蛋白具有生物活性,为中试放大和纯化工艺研究奠定了基础。
- 刘明军王斌钱冬萌丁守怡闫志勇宋旭霞
- 关键词：层析生物活性
- 26肽蜂毒素与基因变构IL-2嵌合蛋白的原核表达、纯化及活性测定被引量：7
- 2004年
- 在E .coliDH5α中表达 2 6肽蜂毒素与基因变构人白细胞介素 2的嵌合体蛋白 ,并进行初步纯化和抗原性检测。利用剪接式重叠延伸 (splicedoverlapextension ,SOE)技术在 2 6肽蜂毒素与基因变构IL 2的基因之间导入四个易形成空间结构的氨基酸残基组成的连接肽 (Gly4Ser) 3 ,构建嵌合体蛋白的基因 ,克隆到原核表达载体pGEX4T 2中 ,重组质粒转化宿主菌DH5α,经IPTG诱导表达目的融合蛋白 ,纯化蛋白经Thrombin酶切后进行SDS PAGE与Western blot鉴定。
- 钱冬萌侯伟闫志勇赵百慧付强王斌
- 关键词：蜂毒素DH嵌合体纯化IPTG剪接
- 重组人IL-21融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性形式表达、纯化及体外对T细胞增殖的影响
- 2008年
- 目的为重组人白细胞介素-21(rhIL-21)的生物学活性和功能研究奠定基础。方法构建重组表达质粒pGEX4T-2/IL-21,通过降低培养温度等优化条件于大肠杆菌中表达出可溶性形式的rhIL-21融合蛋白,纯化后以不同质量浓度作用于T细胞,观察其对T细胞增殖的影响。结果大肠杆菌表达出可溶性形式的rhIL-21融合蛋白,纯化纯度达95%;纯化后的rhIL-21蛋白作用后T细胞增殖增加,且随rhIL-21蛋白质量浓度的增加,T细胞增殖率升高。结论大肠杆菌中获得rhIL-21的可溶性表达形式,纯化后的蛋白对T细胞增殖有促进作用;此为rhIL-21的生物活性及功能研究奠定了基础。
- 刘明军鲁晓晴王斌钱冬萌
- 关键词：大肠杆菌可溶性表达纯化
- 重组人白细胞介素21的制备及免疫学活性分析
- 2009年
- 目的:纯化制备rhIL-21,并分析其免疫学活性。方法:在含重组质粒pGEX4T-2/IL-21的大肠杆菌DH5α中,经IPTG诱导表达出GST-融合蛋白,蛋白经过一系列的纯化,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度。用MTT法研究rhIL-21对T细胞增殖、NK细胞杀伤活性的影响。结果:表达出了可溶性融合蛋白,纯化后的rhIL-21纯度达95%。rhIL-21能促进T细胞增殖,能增强NK细胞杀伤活性。结论:成功制备了rhIL-21,其在体外具有一定的免疫学活性,为其大量制备和体内的生物学活性研究奠定了基础。
- 刘明军孙秀芳钱冬萌王斌
- 关键词：大肠杆菌纯化活性
- 蜂毒肽/变构hIL-2融合蛋白的原核表达及其对宿主菌生长的影响被引量：2
- 2009年
- 目的构建蜂毒肽(Melittin)与变构hIL-2融合基因原核表达质粒,并检测表达的融合蛋白对宿主菌E.coli生长的影响。方法以质粒pGEX-4T-2/Melittin-IL-2(88Arg)为模板,通过PCR定点诱变为Melittin-IL-2(88Arg,125Ala),将PCR产物和pET-15b载体分别经双酶切后连接,构建重组表达质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala),转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE及ELISA分析表达产物;检测诱导不同时间重组菌的A600值,绘制生长曲线,并进行活菌计数。结果PCR扩增的目的片段长542bp,重组表达质粒测序分析证明目的基因如预期突变;ELISA可检测到目的蛋白表达,但表达量较低;SDS-PAGE分析未见目的条带;诱导表达4h,重组菌A600值由0.8下降至0.6;诱导2h,活菌计数由108个/ml降至104个/ml。结论已成功构建了原核表达质粒pET-15b/M-IL-2(88Arg,125Ala),表达的融合蛋白可能对宿主菌具有毒性,从而杀伤宿主菌。
- 郑旭鲁晓晴宋卫青赵巍闫志勇钱冬萌丁守怡宋旭霞徐莉莉李鹏王斌
- 关键词：免疫毒素蜂毒肽白细胞介素-2原核表达
- 基因变构IL-2重组克隆的构建被引量：9
- 2003年
- ①目的 构建基因变构IL 2 (88ArgIL 2 )的重组克隆。②方法 将正常人的扁桃体细胞经PHA刺激后 ,获得cDNA文库 ,并以此为模板 ,经套式PCR扩增得IL 2的基因编码序列。测序确认正确后 ,设计含有突变位点的引物 ,经PCR定点诱变技术获得变构IL 2克隆并进行序列测定。③结果 IL 2基因定点诱变成功 ,并获得了基因变构IL 2重组克隆。④结论 IL 2重组基因变构克隆的构建为进一步在原核和真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型基因变构IL
- 侯伟钱冬萌闫志勇赵百慧付强王斌
- 关键词：白细胞介素2DNA诱变
- IL-21编码基因的克隆及其在大肠杆菌中表达被引量：7
- 2003年
- ①目的 利用基因工程技术从人扁桃体细胞cDNA中克隆出白细胞介素 2 1(IL 2 1)的编码基因 ,并在大肠杆菌中进行表达。②方法 以人扁桃体细胞经PHA刺激的cDNA文库为模板 ,经PCR获得IL 2 1的全基因片段。测序确认后 ,分别设计含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物 ,经PCR获得IL 2 1成熟肽的编码基因。将此IL 2 1基因插入表达载体 pGEX4T 2 ,重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α进行IPTG诱导表达。 ③结果 琼脂糖凝胶电泳显示重组质粒的PCR和双酶切产物与理论值的大小相等。SDS PAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α亦表达一与理论相符的条带。目的蛋白约占总菌体蛋白的 10 %。④结论 成功地构建了IL 2
- 付强钱冬萌闫志勇侯伟赵百慧王斌
- 关键词：白细胞介素21基因表达聚合酶链反应
- 一种白细胞介素2基因变构体的高效表达与纯化工艺
- 2009年
- 利用定点诱变技术构建表达质粒pET15b-MhIL-2并将其在大肠杆菌中进行表达发酵的优化研究,高效表达出可溶性的MhIL-2重组蛋白。蛋白经过亲和层析、Thrombin酶切、离子交换层析和凝胶过滤层析纯化,MhIL-2纯度达95%,且MhIL-2比hIL-2具有更强的促进T细胞增殖生物活性。
- 刘明军王斌宋旭霞钱冬萌
- 关键词：白细胞介素-2纯化
- 表达谷胱甘肽S转移酶-蜂毒素-^(88)精氨酸变体白细胞介素2工程菌的发酵条件研究被引量：1
- 2007年
- 目的研究重组蜂毒素-88精氨酸变体白细胞介素2(Melittin-88ArgIL-2)工程菌的发酵条件。方法采用摇瓶发酵,对含pGEX-4T-2-Melittin-88ArgIL-2重组质粒的工程菌进行诱导表达,研究诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、培养基的pH值等对谷胱甘肽S转移酶-Melittin-88ArgIL-2表达量的影响。同时研究培养温度对产物表达形式的影响。结果根据优化的条件,蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的36%左右。结论确立了该重组melittin-88ArgIL-2工程菌的发酵条件。
- 刘明军王斌钱冬萌丁守怡闫志勇宋旭霞
- 关键词：工程菌
