天津市教委基金(20040805)
- 作品数：4 被引量：12H指数：2
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- 双顺反子翻译偶联表达载体的构建及蚓激酶基因F238在大肠杆菌中的可溶性表达被引量：3
- 2011年
- 为了实现外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,利用硫氧还蛋白作为分子伴侣构建双顺反子翻译偶联表达载体pDICT。将大肠杆菌硫氧还蛋白基因插入到pET22b载体NdeI和EcoR I位点之间,同时在硫氧还蛋白编码基因的终止密码子前加入核糖体结合位点,构建成双顺反子翻译偶联表达载体pDICT。将蚓激酶基因F238克隆到该载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。SDS-PAGE结果表明,所表达的蚓激酶F238是可溶性蛋白。利用血纤维蛋白法对表达产物进行活性测定,重组蚓激酶F238不仅具有纤溶酶活性,而且具有激活纤溶酶原的激酶活性。该双顺反子翻译偶联表达载体的构建,为在大肠杆菌中可溶性表达外源蛋白提供了新方法。
- 黎明宋馨宇王晓娟刘建军张建中刘萌黄云雁
- 关键词：蚓激酶分子伴侣双顺反子可溶性表达
- 蚓激酶基因F238在大肠杆菌中的可溶性表达被引量：1
- 2011年
- 应用PCR技术扩增获得蚓激酶成熟肽基因F238,并将其克隆至大肠杆菌质粒pFT22bTrxA中,构建双顺反子表达载体pTrx-F238。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),1.0mmol/LIPTG、30℃条件下诱导6h,经SDS-PAGE证实蚓激酶成熟肽蛋白获得了高效表达,所表达的蛋白产物相对分子量与预期的26kDa相符,且都是可溶性蛋白,表明分子伴侣TrxA起到了帮助目的蛋白正确折叠的作用。利用血纤维蛋白法对产物活性进行了测定,确定其不仅具有激酶作用,而且具有直接溶栓活性。最高活力可达180U/mL(尿激酶单位)。
- 王晓娟黎明高伟赵洪坤杜连祥路福平
- 关键词：蚓激酶可溶性表达
- 蚯蚓纤溶酶基因的克隆与序列分析被引量：2
- 2006年
- 目的:获取蚯蚓纤溶酶(EFE)的基因,并对其进行序列分析。方法:从赤子爱胜蚓中提取总RNA,然后利用RT-PCR技术扩增EFE的基因,并将其插入pUCm-T载体,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定及分析。结果:DNA序列分析表明,所克隆的EFE基因全长为738bp,其中编码区段为735bp,共编码245个氨基酸残基,成熟肽为238个氨基酸残基。与GenBank中已报道的粉正蚓的EFE序列F-Ⅲ-2的同源性最高,两者在核苷酸序列上有2处不同,即第137位(T→C)和第632位(G→T),密码子也因而分别由GTC、GGT变为GCC、GTT,导致第46位、211位的氨基酸残基分别由缬氨酸、甘氨酸变为丙氨酸和缬氨酸。结论:从赤子爱胜蚓中成功克隆了1条EFE基因F245。序列测定及同源性分析表明,蚯蚓纤溶酶F245与已报道的多条EFE基因序列具有高度同源性,且具备完整的编码区。该序列的克隆为用基因工程的方法生产单一成分的高酶活性EFE奠定了基础。
- 黎明赵明明王敏张键杜连祥
- 关键词：赤子爱胜蚓蚯蚓纤溶酶克隆
- 蚓激酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达被引量：8
- 2006年
- 以赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)体内的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增含自身信号肽的蚓激酶基因F238,将其克隆到pUCm-T载体上,并进行测序。GenBank登录号为:DQ202401。测序结果表明基因全长为738bp,共编码245个氨基酸,包括7个氨基酸的信号肽序列和238个氨基酸的成熟肽序列。与粉正蚓(Lumbricus rubellus)F-III-2相比,核苷酸与氨基酸序列的同源性均为99%,仅存在2个碱基的差异,导致2个氨基酸的突变。通过生物信息学方法对蛋白质的理化及结构特性进行分析预测,F238的等电点为4.61,含有11个半胱氨酸,形成3个二硫键。蛋白质分子主要由β折叠组成,具有丝氨酸活性中心,属丝氨酸蛋白酶超家族胰蛋白酶类。以重组质粒pUCm-T-F238为模板,通过PCR方法扩增去信号肽的蚓激酶基因F238-m,构建毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9-F238-m,将其线性化后用电穿孔法导入酵母宿主菌GS115中。在MM和MD平板上筛选表型,经甲醇诱导后,SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量为28kDa左右,纤维平板法测定活力最高可达100U/mL。
- 赵明明黎明韩振林王敏杜连祥
- 关键词：赤子爱胜蚓蚓激酶克隆毕赤酵母
