国家自然科学基金(30371485)
- 作品数：18 被引量：50H指数：4
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- 相关机构：重庆医科大学西南大学川北医学院附属医院更多>>
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- Klinefelter综合征及双亲X染色体着丝粒区α-卫星DNA变异研究
- 2005年
- 目的:本文从DNA分子水平对Klinifelter综合征患者及双亲X染色体着丝粒区域的α-卫星DNA变异进行研究,探讨Klinefelter综合征患者X染色体不分离形成的原因。方法:采用(representative sampling of multiple repetitive units,rep)PCR方法,通过设计适当的引物,对-卫星DNA多个拷贝串联重复序列同时进行扩增,检测患者、双亲和正常人重复序列中变异发生。结果:(1)扩增产物中分别出现1774bp、570bp(由缺失产生)片段和1410bp、583bp(由缺失产生)、220bp(由缺失产生)片段,(2)患者组570bp和583bp产生率高于正常组,χ2统计有显著性意义(P<0.05)。(3)患者与患者双亲比较差异不显著。结论:Klinefelter综合征患者及双亲的X染色体着丝粒区α-卫星DNA表现出较正常人具更多的变异。提示通过孕前或产前对双亲外周血X染色体着丝粒区域的α-卫星DNA变异分析,对Klinefelter综合征发生风险进行估计,为产前绒毛或羊水染色体检查提供重要的依据。
- 李恬翁亚光王应雄何俊琳刘学庆陈雪梅
- 关键词：非整倍体着丝粒
- CENP-E蛋白动力结构域对细胞周期及染色体分离的影响
- 2009年
- 目的:克隆含CENP-E蛋白动力结构域的真核表达载体,并观察其对染色体分离的影响.方法:采用RT-PCR、分子克隆技术获得含CENP-E动力结构域的真核表达载体pEG-FP-CENPE1(1～336位氨基酸),pEGFP-CENPET1(包括1～336和2078～2492位氨基酸),通过流式细胞术、染色体核型分析观察CENP-E蛋白动力结构域对染色体分离的影响.结果:成功构建出pEGFP-CENPE1,pEGFP-CENPET1融合质粒并在HEK293细胞中正确表达;流式细胞术和染色体核型分析结果表明:转染含CENP-E蛋白动力结构域的载体的细胞在用破坏纺锤体微管药物处理后不能保持于细胞分裂中期,细胞提前进入分裂后期;非整倍体细胞数目增多.结论:过度表达含CENP-E动力结构域不能使受诺考达唑处理的细胞保持于分裂中期,染色体分离出现错误,非整倍体数目细胞增多.
- 刘子杰翁亚光李素彦施琼蔡燕刘斌张燕闫琛
- 关键词：CENP-E结构域细胞周期
- CENP－I表达下调对HEK293细胞生长及染色体分离的影响被引量：1
- 2009年
- 目的构建CENP-I特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制CENP-I基因表达对HEK293细胞生长、细胞周期和染色体数目异常率的影响。方法构建CENP-IsiRNA真核表达载体,脂质体法将pGenesil-1空载体和pGene-sil-1/CENP-I-siRNA-1、pGenesil-1/CENP-I-siRNA-2、pGenesil-1/CENP-I-siRNA-3真核表达载体分别导入人胚肾HEK293细胞。转染后24、48、72h收集细胞用Western blot和FQ-PCR检测HEK293细胞内CENP-I蛋白及mRNA水平的表达情况,以确定干扰效果及最佳干扰时间。MTT法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布,Giemsa染色法计数细胞分裂指数,常规法制备染色体标本。结果成功构建CENP-I siRNA真核表达载体,筛选出具有干扰效果的质粒载体即pGenesil-1/CENP-I-siRNA-3,转染人胚肾HEK293细胞72h后可使CENP-I蛋白及mRNA表达显著下凋。CENP-I表达降低的HEK293细胞生长速度明显减慢(P<0.05),G2/M期细胞增加,分裂期细胞比例增大。结论RNA干扰有效地特异性抑制着丝粒特异性蛋白质CENP-I的表达。CENP-I的抑制可使人胚肾HEK293细胞生长减慢,增殖能力减弱,使细胞分裂期延长。
- 袁泰先蔡燕彭乙华翁亚光施琼刘子杰刘斌李素彦
- 胚胎细胞MAD2基因表达对染色体分离的影响被引量：1
- 2005年
- 目的探讨MAD2基因表达对染色体分离的影响。方法用定量RT-PCR比较RNA干扰前后的胚胎细胞内源性基因MAD2 mRNA表达水平,同时对染色体数目异常率进行比较分析。结果干扰后MAD2基因mRNA拷贝数/GAPDH基因mRNA拷贝数的均值为干扰前的20%,染色体数目异常率均值由干扰前的4.702%上升到28.498%。经统计学分析,RNA干扰后MAD2基因mRNA水平显著下降,染色体数目异常率显著增高。结论MAD2基因表达的降低会导致染色体分离的异常,本研究为染色体分离相关蛋白功能研究建立了新的研究手段和实验评价体系。
- 施琼翁亚光蔡燕刘青松刘子杰
- 关键词：MAD2基因RNA干扰
- 用FRET方法研究与Mps1蛋白有相互作用的CENP-E蛋白结构域被引量：5
- 2009年
- 目的:探索与Mps1蛋白有相互作用的CENP-E蛋白结构域。方法:将重组质粒pEGFP-CENPE2(674～1085位氨基酸)、pEGFP-CENPE3(1200～2134位氨基酸)转染人胚肾293(HEK293)细胞,采用受体漂白荧光共振能量转移方法(FRET方法),检测EGFP-CENPE2、EGFP-CENPE3和Mps1间的能量转移率(Ef),进一步用免疫共沉淀方法验证FRET的实验结果。结果:重组质粒转染HEK293细胞后经激光共聚焦显微镜观察重组质粒表达的融合蛋白与Mps1都存在着共定位;FRET检测结果显示EGFP-CENPE3和Mps1间的能量转移率为[(12.63±0.48)%,n=30],pEGFP-CENPE2和Mps1间的能量转移率为[(3.07±0.21)%,n=30],与对照组[(2.96±0.27)%,n=30]比较pEGFP-CENPE3和Mps1间的能量转移率差异存在显著性(p<0.05),免疫共沉淀实验结果显示EGFP-CENPE3与Mps1蛋白间存在相互作用。结论:FRET技术和免疫共沉淀实验证明了EGFP-CENPE3与Mps1间存在着相互作用。
- 刘子杰翁亚光李素彦施琼蔡燕刘斌张燕阎琛
- 关键词：CENP-E蛋白质相互作用荧光共振能量转移
- 自然流产胚胎组织中人类纺锤体有丝分裂俘获缺陷基因的表达及意义被引量：1
- 2008年
- 目的 探讨自然流产胚胎组织中人类纺锤体有丝分裂俘获缺陷（hsMAD）2基因的表达，以及hsMAD2基因表达降低与染色体数目异常的相关性。方法 采集2006年3月至2007年3月重庆医科大学附属第一、第二医院妇产科自然流产患者的胚胎组织标本33份，其中流产1次者23份，流产2次及以上者10份；同时采集人工流产患者的胚胎组织标本35份。采用FQ-PCR和蛋白印迹法检测自然流产和人工流产胚胎组织中hsMAD2基因的mRNA和蛋白表达水平；原代培养人工流产胚胎组织并经染色体分析筛选出5例具有正常核型的胚胎细胞，构建hsMAD2基因的短发夹RNA（shRNA）表达载体，转染筛选出来的胚胎细胞以抑制其内源性hsMAD2基因的表达，将细胞分为实验1组（转染重组干扰质粒pshRNA-hsMAD2-1）、实验2组（转染pshRNA-hsMAD2-2）、实验3组（转染pshRNA-hsMAD2-3）、对照1组（未做任何处理）、对照2组（转染pTZU6＋1干扰质粒空载体）、无关对照组（转染pshRNA-N1）。用蛋白印迹法和定量PCR技术评价shRNA的干扰效果，四甲基偶氮唑蓝比色法测定胚胎细胞增殖抑制率，流式细胞技术检测胚胎细胞周期的分布，并计算染色体数目的变化。结果 （1）自然流产1次者、自然流产2次及以上者、人工流产者的胚胎组织中hsMAD2基因mRNA的表达量分别为0．00879±0．00035、0．00901±0．00033、0．00941±0．00026，3者分别比较，差异均无统计学意义（P〉0．05）；hsMAD2蛋白的表达量分别为0．2791±0．0311、0．0431±0．0020、0．5790±0．0331，3者分别比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制胚胎细胞中hsMAD2基因的表达，转染有效干扰质粒后，实验1组胚胎细胞的增殖抑制率为54％，分别与对照1组（4％）、对照2组（3％）比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）；G2／M期细胞比例实验1组�
- 蔡燕王箭袁泰先施琼翁亚光王应雄蒋洪彦刘子杰
- 关键词：胚胎钙结合蛋白质类细胞周期蛋白质类小分子干扰
- 2型糖尿病合并高血压患者血清脂联素和内脏脂肪素水平的变化被引量：8
- 2011年
- 目的:了解2型糖尿病合并高血压患者血清脂联素和内脏脂肪素的变化,探讨脂联素和内脏脂肪素与2型糖尿病合并高血压的相关性.方法:选取高血压患者40例,2型糖尿病患者38例,2型糖尿病合并高血压患者40例,健康对照者40例作为研究对象,测定其血清脂联素和内脏脂肪素水平,同时测定血压、血糖、血脂和体质量指数等指标,并分析以上指标与脂联素和内脏脂肪素的关系.结果:单纯2型糖尿病组和单纯高血压组内脏脂肪素水平明显高于正常对照组,分别为(18.26±1.22)ng/mL,(17.31±1.26)ng/mL和(13.32±1.31)ng/mL(p<0.05);2型糖尿病合并高血压组(24.99±1.36)ng/mL又明显高于单纯2型糖尿病组和单纯高血压组.2型糖尿病组和高血压组脂联素水平明显低于正常对照组,分别为(8.75±1.29)μg/mL,(9.71±1.28)μg/mL和(12.67±1.48)μg/mL(p<0.05);2型糖尿病合并高血压组(5.73±1.23)μg/mL又明显低于单纯2型糖尿病组和单纯高血压组.2型糖尿病组和高血压组的脂联素和内脏脂肪素水平差异不具有统计学意义(p>0.05).相关分析显示2型糖尿病合并高血压患者空腹血清内脏脂肪素与腰臀比、甘油三酯和体质量指数呈正相关(r=0.431,0.371,0.501,p<0.05),与高密度脂蛋白呈负相关(r=-0.610,p<0.05);血清脂联素与腰臀比、体质量指数、收缩压和甘油三酯呈负相关(r=-0.6 1 2,-0.3 9 3,-0.4 5 5,-0.3 9 1,p<0.0 5).多元逐步回归分析显示,腰臀比是内脏脂肪素水平的独立相关因素(t=2.0 9 0,p<0.0 5);腰臀比、高密度脂蛋白是脂联素水平独立相关因素(t=-2.7 4 1,3.9 6 8,p<0.0 5).结论:2型糖尿病组和高血压组血清内脏脂肪素水平升高,而脂联素水平降低.2型糖尿病合并高血压组血清内脏脂肪素水平更高,脂联素水平更低.该结论提示脂联素和内脏脂肪素的表达可能与高血压和2型糖尿病的发生发展有密切的关系.
- 刘晓宇翁亚光张燕罗敏
- 关键词：脂联素内脏脂肪素高血压糖尿病2型糖尿病合并高血压
- 染色体数目异常滋养层细胞中CENP-I基因的的异常表达被引量：3
- 2008年
- 目的:探讨人胚胎滋养层细胞中染色体数目异常与着丝粒特异性蛋白质CENP-I表达水平的相关性。方法:T-A克隆制备CENP-I、GAPDH定量PCR标准品;用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化CENP-I重组蛋白,免疫兔制备抗人CENP-I多克隆抗体;采用FQ-PCR和Western-blot检测23例染色体数目异常的滋养层细胞(实验组)和30例具有正常核型的滋养层细胞(对照组)中CENP-ImRNA和蛋白表达水平。结果:成功制备CENP-I、GAPDHFQ-PCR标准品,表达和纯化CENP-I重组蛋白,获得兔抗人CENP-I多克隆抗体;FQ-PCR和Western-blot结果显示CENP-I在实验组和对照组中均有表达,但实验组中CENP-I的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:CENP-I表达的降低可能是导致人胚胎滋养层细胞中染色体数目异常的原因之一。
- 蔡燕王箭袁泰先翁亚光施琼刘子杰刘斌王应雄
- 关键词：滋养层细胞染色体数目异常
- 有丝分裂关卡基因致染色体数目异常自然流产胚胎发生的机制被引量：3
- 2008年
- 目的探讨有丝分裂关卡基因（hBUB1）在染色体数目异常自然流产胚胎发生中的可能机制。方法采用实时定量逆转录（RT）-PCR和免疫印迹法（WB）检测染色体数目异常组和正常对照组的自然流产胚胎组织中目的基因在mRNA和蛋白水平的表达；构建针对hBUB1基因的短发卡状（shRNA）表达载体，用细胞免疫化学、WB和实时定量RT-PCR方法评价其对胚胎细胞内源性hBUB1表达的干扰效果；用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）试验测定细胞增殖抑制率；用流式细胞术解析细胞周期分布。结果hBUB1蛋白在染色体数目异常组中的表达显著低于正常对照组（阳性表达率分别为8％和93．5％，P〈0．05）。shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制胚胎细胞中hBUB1基因的表达（干扰前后mRNA水平分别为0．196±0．067和0．042±0．006，P〈0．05）。胚胎细胞转染有效干扰质粒48h后，染色体数目异常组细胞增殖抑制率达62％，显著高于正常对照组（4％，P〈0．05）。有效干扰质粒引起G2／M期细胞从对照组的40．2％和41．3％降低至21．3％。结论hBUB1基因表达下调可导致细胞增殖的抑制和周期的改变，在染色体数目异常自然流产胚胎发生中可能起很重要的作用，这将为寻找可靠的临床检测指标奠定基础。
- 施琼袁泰先王箭翁亚光王应雄徐远久刘子杰蔡燕
- 关键词：胚胎染色体畸变蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶逆转录聚合酶链反应免疫印迹法
- Klinefelter综合征X染色体着丝粒区α-卫星DNA变异被引量：5
- 2005年
- 目的从DNA分子水平建立研究X染色体着丝粒区域的α-卫星DNA变异的方法,发现K linefelt综合征患者的X染色体着丝粒区域的α-卫星DNA串联重复序列结构变化与染色体不分离的关系。方法采用(representativesamp ling ofmu ltip le repetitive un its,rep)PCR方法,通过设计适当的引物,对α-卫星DNA多个单拷贝串联重复序列同时进行扩增,检测重复序列中结构变化的种类、频率及重组位点。结果首次发现由缺失产生的562 bp和220 bp变异片段和重组位点,异常组的570、562、220 bp构成显著高于正常组(P<0.05)。Logistic回归分析显示:570、562 bp和220 bp 3个短片段同时出现和任两个短片段同时出现均是疾病相关的危险因素。结论K linefelt综合征的X染色体着丝粒区α-卫星DNA过多的重组可能是造成X染色体不分离的重要原因之一。
- 李恬翁亚光王应雄何俊琳刘学庆陈雪梅
- 关键词：聚合酶链反应
