国际科技合作与交流专项项目(2010DFB33450)
- 作品数：4 被引量：15H指数：2
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- 检测白喉毒素特异性细胞毒性的Vero细胞/MTT法的建立
- 2013年
- 目的 建立检测白喉毒素（diphtheria toxin,DT）特异性细胞毒性的Vero细胞/MTT法.方法 用MEM培养液对DT进行不同倍数的预稀释,用目测法确定DT的最适预稀释倍数.用建立的方法检测以最适预稀释倍数稀释的DT,以确定该法的灵敏度和细胞病变半数抑制浓度（IC50）,同时绘制剂量-反应曲线以验证该法的重复性.用建立的方法于不同pH、盐浓度或蔗糖浓度条件下检测DT,计算DT回收率以验证该法的耐用性.结果 目测法确定的DT最适预稀释倍数为106倍.建立的方法的平均检测灵敏度为（6.01±1.44）×10^-5 lf/ml DT,细胞病变半数抑制率对数值（log IC50）范围为5.02 ～ 5.82,变异系数为5.82％,该法具有较好的重复性.用建立的方法检测不同条件下的DT显示,DT的平均回收率为93.7％ ～ 110.4％,该法具有较好的耐用性.结论 Vero细胞/MTr法可用于检测DT特异性细胞毒性.
- 邓杰张珂袁涛张雪梅
- 关键词：白喉毒素VERO细胞特异性细胞毒性
- 动态显色法检测白喉毒素突变体CRM197的细菌内毒素含量被引量：10
- 2013年
- 目的 建立检测白喉毒素突变体CRM197细菌内毒素（bacterial endotoxin）含量的动态显色法（kinetic chromo-genic assay,KCA）。方法 按照《中国药典》三部（2010版）要求,用细菌内毒素检查用水（bacterial endotoxin,BET）稀释细菌内毒素工作标准品制备细菌内毒素标准曲线系列溶液,各浓度均设3个平行孔,分别与动态显色鲎试剂（kinetic chromogenic analysis tachypleus amebocyte lysate,KCA TAL）反应,绘制标准曲线,验证标准曲线的可靠性,确定最佳线性范围、测定范围及最低检测限（limit of quantitation,LOQ）,验证方法的精密性和准确性,并进行初步应用。结果 标准曲线的回归方程为：y=-0.263x＋2.741,R2=0.997,相关系数的绝对值∣r∣逸0.980,阴性对照的反应时间大于标准曲线最低点的反应时间,各复孔的变异系数（CV）约10%;内毒素浓度在0.02～2.50 EU/ml时,线性关系良好,LOQ为0.02 EU/ml;3个浓度（2.50、0.50、0.02 EU/ml）标准内毒素检测结果的CV均〈5%,加入高、中、低3个浓度（2.50、0.50、0.02 EU/ml）标准内毒素的3批供试品检测结果的CV均〈10%,回收率在95%～143%之间;采用建立的方法检测10批次CRM197样品的细菌内毒素含量,回收率在77%～118%之间,其中8批样品的内毒素含量合格。结论 动态显色法检测CRM197中内毒素的含量精密性和准确性良好,能快速、定量检测样品中的内毒素含量,抗干扰能力强,可用于CRM197研制过程中的质量控制。
- 邓杰张珂袁涛李春阳
- 关键词：细菌内毒素
- 白喉毒素无毒突变体CRM197基因的克隆与表达被引量：3
- 2014年
- 目的构建白喉毒素(Diphtheria toxin)无毒突变体CRM197(Cross-reacting materials 197)的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法以白喉杆菌(ATCC39255)基因组DNA为模版,采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增CRM197基因,插入表达载体pET11b中,构建重组原核表达质粒pET11b-CRM197。经双酶切及测序鉴定正确后,重组质粒被转化入大肠杆菌Rosetta 2(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,结果表明与预期一致;表达的重组蛋白相对分子质量约58 000,并可与鼠抗CRM197单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组原核表达载体pET11b-CRM197,重组的CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了表达,为以该重组突变体作蛋白载体制备结合疫苗奠定了基础。
- 周宇赵兆袁涛李晓容李春阳
- 关键词：白喉毒素克隆载体蛋白
