国家自然科学基金(30471750)
- 作品数：9 被引量：55H指数：4
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- rAAV2-CTGF和TIMP1双基因联合转染恒河猴退变腰椎间盘的生物学效应被引量：4
- 2010年
- 目的研究腺相关病毒（adeno—associated virus2，AAV2）介导的结缔组织生长冈子（connective tissue growth factor，CTGF）和基质金属蛋白酶组织抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinasesl，TIMP1）双基因体内转染退变的恒河猴腰椎间盘的生物学效应。方法恒河猴9只，雌性4只，雄性5只；年龄4-7岁，体重4．5-7kg。CT引导下经皮穿刺纤维环诱导恒河猴腰椎间盘退变，微创经皮注入携带CTGF和TlMPI双基因腺相关病毒颗粒。应用Rrr_PCR测定细胞因子的表达，RT—PCR、35S整合法观察双基因联合转染对退变椎间盘的生物学作用。结果双基因转染后8、16、24周时CTGFmRNA表达量分别为PBS对照组的10．02、2．39、0．91倍；TIMPImRNA表达量分别为PBS对照组的6．08、3．8l、2．67倍；Ⅱ型胶mRNA表达量分别为PBS对照组的145．51％、174．72％、113．73％；蛋白多糖mRNA表达量分别为PBS对照组的461．19％、191．46％、301．39％；蛋白多糖合成效率为分别PBS对照组的455．06％、285．97％、165．58％。结论CTGF和TIMPI双基因联合转染后可以在体内较长期表达，并能促进体内蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成，延缓椎间盘的退变。
- 孔杰胡有谷刘勇齐宗华
- 关键词：基质金属蛋白酶1恒河猴椎间盘
- Combined expression of CTGF and tissue inhibitor of metalloprotease-1 promotes synthesis of proteoglycan and collagen type Ⅱ in rhesus monkey lumbar intervertebral disc cells in vitro被引量：17
- 2010年
- 背景腰骶部疼痛作为学习试图建立的 intervertebral 圆盘 degeneration.This 经常引起的普遍疾病出现了一在里面恒河猴的 vitro 房间文化模型腰部的 intervertebral 磁盘并且表示调停了调查联合结缔组织生长因素( CTGF )和 metalloprotease-1 ( TIMP-1 )的组织禁止者的效果由骨胶原类型和这些调查的 proteoglycan levels.The 目的上的 联系adeno 的病毒( AAV )是探索潜在的方法
- LIU Yong KONG Jie CHEN Bo-hua HU You-gu
- 关键词：金属蛋白酶抑制因子胶原合成蛋白多糖CTGF
- 应用微创技术建立恒河猴腰椎间盘早期退变模型被引量：7
- 2008年
- 目的应用CT定位，经皮穿刺纤维环诱导恒河猴腰椎间盘退变，建立灵长类动物腰椎间盘早期退变模型。方法恒河猴13只，随机分为三组：（1）造模组：在CT定位下，用20G穿刺针从左侧后方入路经皮穿刺L1，2（n=12），L2，3、L3，4、L4，5、L5，6（n=13）椎间盘的纤维环全层至椎间盘髓核正中，共64个椎间盘。（2）穿刺对照组：15G穿刺针穿刺1只猴的L1，2椎间盘。（3）正常对照组：L6，7，L7—S1，共26个椎间盘。造模前及造模后4、8、12周对各组椎间盘行MRI检查，并行HE、Masson、番红O、免疫组织化学染色组织学观察。结果（1）MRI：20G穿刺针穿刺的造模组椎间盘造模前及造模后4、8、12周，椎间盘信号强度按Pfirmann分级均为Ⅰ级。15G穿刺针穿刺椎间盘4周时信号降低（Pfirrmann Ⅲ级），8周时为黑色椎间盘（Pfirmann Ⅳ级）。正常对照组椎间盘为Pfirmann Ⅰ级。（2）组织学：造模组椎间盘造模后4周未见改变，8周时HE染色示髓核内细胞数减少，12周时较为明显。Masson染色4周未见改变，8周时各层纤维间出现裂隙，12周时裂隙增宽。番红O染色见8、12周髓核内蛋白聚糖进行性减少。免疫组织化学结果显示4周和8周时同正常椎间盘比较差异无统计学意义（P〉0．05），12周时，Ⅱ型胶原合成减少（P〈0．05）。15G穿刺对照组在8周时HE染色见髓核内细胞减少明显，Masson染色见纤维环各层间裂隙明显，呈波浪状。番红O染色示髓核内蛋白聚糖数量明显减少。免疫组织化学染色示Ⅱ型胶原合成减少。正常对照组在各时间点未见到形态学改变。结论20G穿刺针可以诱发椎间盘缓慢进展的轻度退变。MRI平均信号强度观察椎间盘轻度退变时，不是敏感的指标，需要依靠组织学证实。
- 孔杰王子轩季爱玉王德春齐宗华徐文坚郝大鹏段峰胡有谷
- 关键词：椎间盘恒河猴
- 人基质金属蛋白酶组织抑制剂1腺相关病毒表达质粒的构建及检测被引量：1
- 2007年
- 目的构建含人基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases1,TIMP1)的腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)表达质粒并观察其在人胚肾293(HEK293)细胞中的表达,为进一步逆转椎间盘退变提供依据。方法以含有人TIMP1基因序列的质粒pBLAST49-hTIMP1为模板,通过PCR的方法扩增出TIMP1基因,再采用分子克隆的方法,把TIMP1克隆到AAV表达质粒pSNAV2.0构建重组质粒pSNAV2-TIMP1。把重组质粒转染HEK293细胞,用免疫荧光和Western blot的方法对重组质粒的表达进行研究,ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP1蛋白的含量。结果PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的TIMP1基因序列的AAV表达质粒pSNAV2-TIMP1。体外成功转染入HEK293细胞,免疫荧光、Western blot及ELISA的结果表明重组质粒能够高表达TIMP1蛋白。结论成功构建了表达TIMP1的重组质粒pSNAV2-TIMP1,并证实在蛋白质水平获得了表达,为进一步逆转椎间盘退变研究奠定了基础。
- 魏见伟王德春胡有谷
- 关键词：TIMP-1腺相关病毒质粒构建椎间盘
- pSNAV_2-CTGF重组质粒构建及其在人胚肾293细胞中的表达
- 2007年
- 目的构建含人结缔组织生长因子(CTGF)的腺相关病毒(AAV)表达载体,并观察其在人胚肾293(HEK293)细胞中的表达。方法以含有人CTGF基因序列的质粒pCMV-SPORT6为模板,应用PCR克隆出CTGF基因,采用分子克隆的方法把CTGF克隆到AAV表达载体pSNAV2.0上构建重组质粒pSNAV2-CTGF。把重组质粒转染HEK293细胞,用免疫荧光法对重组质粒目的蛋白的表达进行研究,MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性。结果成功构建完全正确的CTGF基因序列的AAV表达载体pSNAV2-CTGF,将其转染HEK293细胞后,免疫荧光检测到目的蛋白的表达,转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性。结论成功构建了真核表达载体pSNAV2-CTGF,转染HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的CTGF蛋白。
- 魏见伟王德春胡有谷
- 关键词：结缔组织生长因子腺相关病毒基因转染椎间盘
- 人CTGF和TIMP1基因重组腺相关病毒双表达质粒的构建及其活性检测
- 2008年
- 目的构建人结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases1,TI MP1)基因腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)表达质粒,并观察其在HEK293细胞中的表达,检测目的蛋白的生物学活性。方法采用PCR技术,分别设计引物扩增所需序列并进行PCR鉴定。再采用分子克隆的方法,以内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites,IRES)序列连接CTGF和TI MP1并克隆到AAV表达质粒pSNAV2.0构建重组质粒pSNAV2-CTGF-IRES-TI MP1。把重组质粒转染HEK293细胞,用双重免疫荧光和Western blot的方法对重组质粒的表达进行研究,MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性,ELISA法检测细胞培养上清液中TI MP1蛋白的含量。结果PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的CTGF和TI MP1基因序列的AAV表达质粒。双重免疫荧光和Western blot检测到目的蛋白的表达,转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性,ELISA法结果证实重组载体能够高表达TI MP1蛋白。结论成功构建了双表达质粒pSNAV2-CTGF-IRES-TI MP1,转染HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的目的蛋白,为基因治疗椎间盘退变的研究工作奠定了基础。
- 魏见伟王德春胡有谷
- 关键词：基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因载体腺相关病毒
- 腺相关病毒载体介导的TIMP1对人退变腰椎间盘髓核细胞蛋白多糖的影响被引量：6
- 2008年
- 目的:探讨腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体介导的基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1)对人退变腰椎间盘髓核细胞的生物学效应。方法:单层培养并鉴定人退变腰椎间盘髓核细胞。采用绿色荧光蛋白标记的腺相关病毒(rAAV2-EGFP)检测其对髓核细胞的转染效率。应用构建的rAAV2-TIMP1转染髓核细胞,通过细胞形态学观察、35S标记氨基酸整合法检测rAAV2-TIMP1对人退变腰椎间盘髓核细胞基质合成的影响。在35S检测中,以未转染的退变髓核细胞做为正常对照组。结果:光镜下观察所培养的细胞类型以成纤维样细胞为主,Ⅱ型胶原免疫组化和番红O染色鉴定培养细胞为髓核细胞。AAV转染人退变腰椎间盘髓核细胞的转染效率为12%。35S标记整合法检测rAAV2-TIMP1转染组每分钟计数值为341.43±42.85,正常对照组为224.20±29.26,两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TIMP1能够促进退变椎间盘髓核细胞蛋白多糖的合成。
- 魏见伟王德春胡有谷
- 关键词：基质金属蛋白酶组织抑制剂1蛋白多糖腺相关病毒椎间盘
- Transplantation of gene-modified nucleus pulposus cells reverses rabbit intervertebral disc degeneration被引量：22
- 2011年
- 背景 Intervertebral 圆盘退化是腰骶部疼痛的主要原因。这研究的目的是为由修改基因的原子核 pulposus 房间的移植颠倒腰部的 intervertebral 磁盘的退化进兔子探索潜在的方法退化的在有 联系adeno 的病毒的 transfecting 兔子原子核 pulposus 房间以后的腰部的 intervertebral 磁盘( AAV2 ) 2 调停了结缔组织生长因素( CTGF )和组织禁止者 metalloproteinases 1 ( TIMP1 )在 vitro.Methods 计算机断层摄影术( CT )的基因指导了经皮的体环 fibrosus injur rAAV2-CTGF-IRES-TIMP1-transfected 兔子原子核 pulposus 房间被移植进退化腰部的 intervertebral 磁盘(移植组) ，缓冲磷酸盐盐(PBS ) 被注入退化腰部的 intervertebral 磁盘(退化控制组) ，正常腰部的 intervertebral 磁盘担任了一个空白的控制组。在 6 ， 10 和 14 个星期以后，磁盘高度索引( DHI )和在 intervertebral 磁盘的信号紧张被X光检查和 CTGF 的磁性的回声成像( MRI ) analysis.The 表示观察，在原子核 pulposus 织物的 TIMP1 被西方的弄污决定分析， proteoglycan 的合成效率被35S硫酸盐加入试金，和类型骨胶原的 mRNA 表达式决定， proteoglycan 被证实的 RT-PCR.Results MRI 检测那退化 intervertebral 磁盘MRI 显示退化 intervertebral 磁盘与退化控制组相比在移植组被减轻。骨胶原 mRNA 和 proteoglycan mRNA 的表示与退化控制组( P 0.05 )相比在移植组和空白的控制组是显著地更高的 指导CT 的经皮的刺能成功地造的 .Conclusions 退化 intervertebral 圆盘 models.Both CTGF 和 TIMP1-transfected 房间移植帮助维持圆盘高度的兔子，并且在 intervertebral 磁盘支持类型骨胶原和 proteoglycan 的生合成，颠倒 i
- LIU YongLI Jian-minHU You-gu
- 关键词：新西兰白兔退变结缔组织生长因子
- 人正常和退变腰椎间盘中TIMP_1的表达及其意义被引量：3
- 2008年
- 目的探讨金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)mRNA在正常与退变椎间盘中表达的差别及意义。方法利用荧光定量PCR技术检测TIMP1mRNA在正常椎间盘(9个)与退变椎间盘(30个)组织的含量,结合年龄、病程、病理类型进行分析。结果TIMP1在正常椎间盘组织表达量为0.900±0.289,退变椎间盘中TIMP1mRNA表达量为0.340±0.241,两者差异有显著性(t=5.841,P<0.05)。退变椎间盘中,不同年龄、病程及病理类型组间TIMP1mRNA的表达量差异无统计学意义。结论TIMP1mRNA的含量下降在腰椎间盘退变过程中起着重要作用,但未见与年龄、病程及病理类型有明显的关系。
- 孔杰马斌胡有谷陈伯华
- 关键词：椎间盘金属蛋白酶1组织抑制剂
