国家自然科学基金(81201368)
- 作品数：19 被引量：17H指数：3
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- 相关机构：安徽医科大学安徽医科大学第四附属医院安徽医科大学第一附属医院更多>>
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- 人通用转录因子GTFIIF2表达与定位
- 2014年
- 目的构建不同标签的人通用转录因子IIF多肽2(GTFIIF2)表达载体,观察其细胞内的表达和定位。方法设计GTFIIF2的引物,以全长cDNA序列为模板,利用聚合酶链式反应技术扩增GTFIIF2全长序列,构建pcDNA3.1-FLAG-GTFIIF2和pCDGFP-GTFIIF2质粒,利用Western blot法和免疫荧光法检测其在细胞表达与定位;构建GST-GTFIIF2质粒,转化到BL21菌株,用IPTG诱导剂诱导融合蛋白表达,用SDS-PAGE分析诱导表达情况。结果免疫荧光法检测GTFIIF2蛋白集中分布在COS7细胞核中,在细胞质没有分布;pcDNA3.1-FLAG-GTFIIF2和pCDGFP-GTFIIF2质粒能够在HEK293T细胞中有效表达;GST-GTFIIF2在BL21菌株中很好的诱导表达。结论 GTFIIF2在COS7细胞、HEK293T细胞和BL21感受态细胞中能有效表达,为更好地了解GTFIIF2蛋白在细胞内的功能提供一定的研究基础。
- 赵健耿慧武乔正李春雨李克娟刘晓颖范礼斌
- 关键词：基因表达蛋白定位BL21
- Sedlin突变体的表达及其与RB1在细胞中的共定位被引量：2
- 2019年
- 目的构建脊椎骨骺发育不良蛋白(Sedlin)的缺失突变和点突变体质粒,检测其在细胞内的表达、定位及其与RB1蛋白的共定位情况,为后续研究蛋白质相互作用提供依据。方法以Sedlin全长cDNA序列为模板,扩增目的基因序列,连接至表达载体,构建3个原核表达质粒,即pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和相应的真核表达质粒,即pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F。分别转化pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F到大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达、谷胱甘肽琼脂糖球珠纯化后进行SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色法检测其表达情况;分别转染pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F于HEK 293T细胞,Western blot法检测相关蛋白在真核细胞中的表达情况;分别单转pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F以及将上述质粒与pDNA3.1-FLAG-RB1共转到COS7细胞中,进行免疫荧光制片,观察其在真核细胞内的定位情况。结果测序结果显示pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F重组质粒构建成功;考马斯亮蓝染色显示融合蛋白GST-SedlinN/Y115A/Y115F在BL21细胞中能够大量表达;Western blot结果显示GFP-SedlinN/Y115A/Y115F在HEK 293T细胞中能够高效表达;免疫荧光结果显示GFP-SedlinN/Y115A/Y115F蛋白在COS7细胞的细胞质和细胞核中均有分布,并与RB1蛋白存在明显的核内共定位。结论人Sedlin及其突变体在BL21菌株和HEK 293T细胞中均能有效表达;在COS7细胞中,Sedlin主要表达于细胞核,而Sedlin突变体除在细胞核中表达外,在细胞质中也有相当量的表达,Sedlin及其突变体均与RB1蛋白共定位,显示Sedlin羧基端以及NPFY基序中的Y磷酸化与否并不影响与RB1蛋白的共定位。
- 何叶潘林鑫张永范礼斌刘晓颖
- 关键词：突变体质粒构建蛋白表达免疫荧光
- 补体成分C3及其缺失突变体蛋白的表达及与CLIC1蛋白共定位的研究
- 2015年
- 目的研究补体成分C3及其缺失突变体C3(1-840)、C3(824-1663)在真核细胞内的表达及与氯离子通道蛋白(CLIC1)的共定位。方法构建pc DNA3.1-C3-FLAG、pc DNA3.1-C3(1-840)-FLAG、pc DNA3.1-C3(824-1663)-FLAG三个真核表达质粒(缺失突变体根据C3的结构域及其裂解断裂位置设计),并分别转染至HEK 293T细胞中,Western blot检测表达情况;上述质粒分别瞬时单转至COS7细胞和分别与GFP-CLIC1共转至COS7细胞内,观察共定位情况。结果成功构建带FLAG标签的C3基因及其两个缺失突变体[C3(1-840)、C3(824-1663)]的真核表达载体,Western blot结果显示它们在HEK 293T细胞中均能成功表达;免疫荧光显示它们在COS7细胞中均主要分布于细胞质,且三个真核表达载体中只有C3(824-1663)与CLIC1有共定位。结论补体C3及其缺失突变体C3(1-840)和C3(824-1663)在HEK 293T、COS7细胞中均能高效表达,且主要分布在细胞质内,C3(824-1663)与CLIC1蛋白有共定位。
- 王二宁陈丹丹刘晓颖范礼斌
- 关键词：C3转染基因表达
- RACK1及其缺失突变体与CLIC1的共定位研究
- 2015年
- 目的运用分子克隆技术构建活化蛋白激酶C受体1(RACK1)突变体的真核表达质粒,进行RACK1突变体的表达、定位及其与胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)蛋白的共定位研究,为其进一步的功能研究奠定基础。方法以RACK1全长c DNA序列为模板,构建真核表达质粒pc DNA3.1-RACK1-N(1-138)-FLAG、pc DNA3.1-RACK1-C(130-317)-FLAG;Western blot法检测突变体在哺乳动物细胞中的表达;用免疫荧光技术了解突变体蛋白在哺乳动物细胞中的共定位情况。结果成功构建了RACK1突变体的真核表达质粒;Western blot法检测到蛋白主要在胞质中表达,核内有部分表达;免疫荧光实验表明,RACK1及突变体蛋白主要定位在胞质与核膜,细胞核中也有少量表达,与CLIC1蛋白存在共定位。结论成功构建了RACK1缺失突变体,并在真核细胞中成功表达;RACK1及突变体与CLIC1蛋白在哺乳动物细胞中均存在不同程度的共定位,蛋白之间可能存在相互作用,为RACK1蛋白的功能研究奠定了基础。
- 王蓓华朱亮亮刘晓颖范礼斌
- 关键词：RACK1质粒构建免疫荧光BLOT
- 肌营养不良蛋白及其衍生物的表达与定位的研究被引量：3
- 2015年
- 目的研究肌营养不良蛋白(DG)及其衍生物α-DG、β-DG在真核细胞内的表达与定位。方法构建pcDNA3.1-DAG1-FLAG、pcDNA3.1-DAG1α-FLAG和pcDNA3.1-DAG1β-FLAG 3个真核表达质粒,并分别转染至HEK 293T细胞中;提取总蛋白,Western blot检测表达情况;分别转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察细胞定位情况。结果成功构建了带有DAG1、DAG1α、DAG1β基因的真核表达载体,且在HEK 293T细胞中都能有效表达,在COS7细胞中主要分布于细胞质。结论DG及其衍生物α-DG、β-DG在HEK293T、COS7细胞中均有表达,主要分布在细胞质内,为进一步了解DAG1的功能提供了细胞学基础。
- 钱成王蓓华徐雪琴潘林鑫李新颖刘晓颖范礼斌
- 关键词：转染基因表达
- 通用转录因子GTFⅡF2对食管癌细胞增殖、迁移的影响
- 2016年
- 目的研究通用转录因子ⅡF多肽2(GTFⅡF2)的表达对食管癌细胞增殖及迁移的影响。方法人工合成靶向GTFⅡF2基因的siRNA序列和阴性对照siRNA序列及质粒pc DNA3.1-GTFⅡF2-FLAG,分别转染至食管癌细胞中,采用克隆形成实验和细胞划痕实验观察其对食管癌细胞增殖和迁移的影响。结果 RNA干扰技术靶向沉默GTFⅡF2基因表达后,食管癌细胞增殖和迁移均明显受到了抑制,而过表达GTFⅡF2对食管癌细胞的增殖和迁移无明显影响。结论GTFⅡF2基因在食管癌细胞TE-1、ECA-109的增殖和迁移过程中发挥重要作用,为进一步了解GTFⅡF2基因抑制TE-1、ECA-109细胞增殖和迁移的机制提供了基础。
- 陈丹丹耿慧武潘林鑫刘晓颖范礼斌
- 关键词：RNA干扰细胞增殖细胞迁移
- 人β4GalTⅡ基因在哺乳动物细胞株中的表达与定位
- 2015年
- 目的运用基因克隆技术构建人源β1,4-半乳糖转移酶Ⅱ(β4Gal TⅡ)真核表达质粒,并将其转染到COS7细胞中,观察蛋白在细胞内的定位,同时转染到HEK 293T细胞中检测其表达。方法分别设计带FLAG标签和GFP标签的β4Gal TⅡ基因的特异性引物,以含人β4Gal TⅡ全长c DNA序列为模板,定向构建到pc DNA3.1(+)及p CDGFP真核表达载体中,构建重组表达质粒。通过酶切和测序鉴定阳性重组质粒,利用Lipofectamine 2000分别转染COS7、HEK 293T细胞,免疫荧光显微镜观察重组蛋白在细胞内的定位,Western blot法鉴定重组蛋白的表达。结果成功构建pc DNA3.1-β4Gal TⅡ-FLAG和p CDGFP-β4Gal TⅡ重组表达载体,定位实验表明:β4Gal TⅡ-FLAG和GFP-β4Gal TⅡ二者在COS7细胞中均主要定位在细胞核周围,并有明显的块状染色,胞核中未见明显分布;Western blot法检测显示重组β4Gal TⅡ蛋白在HEK 293T细胞中稳定表达。结论获得了人β4Gal TⅡ的真核表达质粒,并能在COS7和HEK 293T细胞中表达,为进一步研究β4Gal TⅡ的功能及其与其他蛋白的相互作用奠定了一定基础。
- 徐雪琴潘林鑫耿慧武刘晓颖范礼斌
- 关键词：转染细胞定位蛋白表达
- 人类胞内氯离子通道蛋白3在原核细胞及真核细胞内的表达
- 2014年
- 目的研究人类胞内氯离子通道蛋白3(CLIC3)在真核细胞中的定位和表达,及其GST融合蛋白在原核细胞中的表达。方法以含人CLIC3的全长cDNA序列的质粒为模板,PCR扩增CLIC3片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-CLIC3-FLAG,检测其定位及表达;构建原核表达载体pGEX-5X-3-CLIC3,转化到大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白GST-CLIC3表达。结果细胞免疫荧光结果表明CLIC3在COS7细胞质和细胞核中均有分布;Western blot结果显示CLIC3在HEK-293T细胞中能有效表达;考马斯亮蓝染色结果表明融合蛋白GST-CLIC3在BL21菌株中能有效表达。结论人类的CLIC3蛋白COS7、HEK-293T及大肠杆菌BL21菌株均能有效表达,为进一步了解CLIC3的功能奠定了一定的基础。
- 李春雨潘林鑫刘晓颖范礼斌
- 关键词：细胞定位蛋白表达
- 人RB1及其突变体的表达与定位被引量：6
- 2013年
- 目的研究人RB1及其缺失突变体蛋白在细胞内的表达与定位。方法以含人RB1全长cDNA序列的质粒为模板,通过PCR方法分别扩增出RB1全长及其三段缺失突变体序列,然后分别构建其表达载体,利用Western blot法和免疫荧光法检测其在细胞株中的表达与定位。结果成功构建了pCDNA3.1-FLAG-RB1及其缺失突变体的表达载体,Western blot法结果证明其在细胞中都能有效地表达,免疫荧光的结果显示了RB1主要分布在细胞核,但其缺失突变体在细胞质中也有分布。结论人RB1在HEK 293T、COS7细胞中均有表达,且主要分布在细胞核内,其缺失突变体在胞质中也有分布,这为进一步了解人RB1的功能提供了一定的基础。
- 潘林鑫李新颖徐南李克娟乔正耿慧武刘晓颖范礼斌
- 关键词：RB1转染基因表达细胞定位
- 人EBI3蛋白及其突变体的表达及定位研究被引量：1
- 2016年
- 目的 研究人EB病毒诱导的基因3（EBI3）及其突变体在哺乳动物细胞中的表达及定位差异及其原因。方法 基于NCBI数据库中人EBI3氨基酸的序列分析,利用分子克隆技术构建人EBI3真核表达质粒pcDNA3.1-EBI3-FLAG、单独包含氨基端或羧基端Ⅲ型纤连蛋白（FN3）结构域的缺失突变体的表达质粒pcDNA3.1-EBI3（1~135）-FLAG和pcDNA3.1-EBI3（125~230）-FLAG以及第210位天冬氨酸（Asp）点突变体Asp210的表达质粒pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG;Westernblot方法检测EBI3及其突变体在HEK293T细胞中的表达;免疫荧光实验观察人EBI3及各突变体在COS7细胞中的定位。结果 成功构建了下游携带FLAG标签的人EBI3及其突变体的真核表达质粒;Westernblot结果显示重组蛋白均能在HEK293T细胞中稳定表达;经激光共聚焦显微镜观察,EBI3及其缺失突变体在COS7细胞的表达位置发生明显变化。结论 人EBI3及其突变体真核表达质粒均能在HEK293T、COS7细胞中成功表达;人EBI3缺失突变体在COS7细胞中的定位发生明显变化,氨基端结构域可能在EBI3蛋白的正确定位中发挥重要作用;EBI3蛋白的第210位Asp的突变影响了其在细胞内的定位。
- 邢雪梅耿慧武潘林鑫刘泽宇姚亮邓欢欢刘晓颖范礼斌
- 关键词：质粒构建WESTERNBLOT免疫荧光
