国家杰出青年科学基金(30225041)
- 作品数：6 被引量：27H指数：3
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- 相关机构：第二军医大学佳木斯大学更多>>
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- 伯氏疟原虫顶端膜抗原1胞外区及其亚区的表达与免疫保护作用分析
- 2007年
- 目的表达伯氏疟原虫顶端膜抗原1(PbAMA-1)胞外区E及其各亚区,分析其免疫原性和免疫保护作用。方法抽提伯氏疟原虫基因组,对PbAMA-1基因测序,依据该序列采用毕赤酵母密码子使用频率重新设计PbA-MA-1基因序列。将其胞外区E分为3个彼此重叠的基因片段DⅠ、DⅡ和DⅢ并进行优化,人工合成后在大肠埃希菌中诱导表达。表达产物经纯化和重折叠,分别与福氏佐剂乳化后免疫小鼠和家兔,均免疫3次,间隔2周。每次免疫剂量,小鼠为20$g,家兔为100$g。ELISA检测抗体效价,并以疟原虫攻击实验确定各抗原的免疫保护效果。结果测得的PbAMA-1基因序列与Sanger测序中心公布的序列完全一致。密码子优化并人工合成的DⅠ、DⅡ、DⅢ和E目的基因片段在大肠埃希菌表达载体pET32a均获得诱导表达,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,各目的基因表达产物大小与预计的相对分子质量Mr 44 300、Mr 33 300、Mr 29 900和Mr 67 200相一致。表达产物经镍离子螯合柱(Ni-NTA柱)纯化和谷胱甘肽(GSH)氧化还原法体外重折叠,蛋白纯度达90%以上,各纯化的重组蛋白在小鼠体内均激发产生高滴度抗体。其中,完整的胞外区E第3次免疫后抗体滴度为(34.4±0.15)×10-4,与其他组相比,免疫原性较其他各亚区更强(t=5.66,P<0.01;t=2.27,P<0.05和t=5.05,P<0.01)。取家兔免疫血清与感染伯氏疟原虫ANKA株的小鼠血膜抗原片进行间接荧光抗体试验(IFAT),均为阳性,其中抗E的抗血清免疫荧光强度最高,与ELISA检测的抗体水平一致。取家兔抗血清对小鼠伯氏疟原虫粗提抗原进行蛋白质印迹(Western blot)分析,产生特异性反应条带,表明能够识别天然的PbAMA-1蛋白。免疫小鼠在以伯氏疟原虫攻击实验中得到部分保护,DⅠ、DⅡ、DⅢ和E各免疫组小鼠与佐剂对照组相比,存活时间明显延长(t=2.78,P<0.05;t=2.67,P<0.05;t=3.46,P<0.01和t=3.50,P<0.01)。结论�
- 李树玲张冬梅曹毅潘卫庆
- 关键词：伯氏疟原虫顶端膜抗原1免疫原性
- 重组恶性疟原虫红细胞结合抗原175功能区的制备及联合免疫被引量：6
- 2004年
- 目的 :全合成恶性疟原虫 eba- 1 75 f2基因并在毕氏酵母中进行高效分泌表达 ,用该重组蛋白与我室研制的疟疾疫苗候选抗原 Pf CP- 2 .9进行联合免疫以观察是否存在竞争性免疫抑制。方法 :采用不对称 PCR法拼接合成 eba- 1 75 f2基因(95 9bp) ,用电转化方法将合成基因导入毕氏酵母中并进行诱导表达 ,采用离子交换层析和分子筛层析纯化 EBA- 1 75 F2蛋白。 结果 :全合成 eba- 1 75 f2基因在毕氏酵母中高效分泌表达。重组 EBA- 1 75 F2和 Pf CP- 2 .9联合免疫后 ,以 EL ISA和IFA检测 ,针对 2个蛋白联合免疫的抗体滴度明显高于 2个蛋白单独免疫的滴度。 结论 :重组 EBA- 1 75 F2和 Pf CP- 2 .9联合免疫时不存在竞争性免疫抑制 ,这
- 张冬梅潘卫庆
- 关键词：联合免疫恶性疟原虫疟疾疫苗
- 恶性疟原虫红前期多表位融合抗原基因的构建及其高效表达被引量：1
- 2004年
- 目的 :构建一个恶性疟原虫红前期多表位融合抗原基因 (Pf CP- TCL) ,并在毕氏酵母中进行高效分泌表达。 方法 :选取了疟原虫红外期疫苗候选抗原 CSP、TRAP和 L SA- 1中的一些重要 T、B细胞表位 ,按一定的次序加以串联连接 ,并全合成该融合基因。在毕氏酵母中进行分泌表达 ,并纯化表达产物。结果 :合成的基因在毕氏酵母中高水平分泌表达 ,产量达 1 g/L 以上。经离子交换和凝胶过滤 2步纯化过程 ,获得纯度在 95 %以上的重组蛋白。 结论 :全合成的多表位融合抗原基因能在毕氏酵母中高水平分泌表达 ,并产生一种工艺简易的纯化方法。
- 张青锋潘卫庆
- 关键词：恶性疟原虫基因表达
- 转基因伯氏疟原虫的建立及报告基因表达的初步研究
- 2004年
- 目的 :通过转染含有绿色荧光蛋白 (GFP)和 Pbf MSP1片段的重组质粒 ,建立伯氏疟原虫转染技术和表达恶性疟原虫 MSP- 1 1 90 0 0片段 (Pf MSP1 - 1 9)的转基因伯氏疟原虫。方法 :构建重组转染质粒 Pyr Flu/Pbf MSP1。伯氏疟原虫 ANKA株经培养和分离后用电转化方法转入重组转染质粒 ,药物筛选转化原虫后进行 PCR检测 ,并于荧光显微镜下检测报告基因GFP的表达。结果 :构建了重组转染质粒 Pyr Flu/Pbf MSP1。荧光显微镜下观察到呈绿色荧光的伯氏疟原虫。PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在 GFP和 Pbf MSP1基因。结论 :重组质粒已成功转染伯氏疟原虫并表达了 GFP报告基因 。
- 曹毅张冬梅李树玲潘卫庆
- 关键词：转基因伯氏疟原虫基因表达绿色荧光蛋白
- 疟疾疫苗研究的现状和展望被引量：17
- 2004年
- 疟原虫抗药性及疟蚊对杀虫剂抗性的产生和迅速扩散迫切需要研究新的疟疾防治方法 ,以控制该传染病的流行。根据自愿者试验、动物模型及现场研究结果 ,研制疫苗预防疟疾是可行的。当前 ,全球科学家正在研制 3种类型的疟疾疫苗——抗红内期原虫疫苗、抗红前期原虫疫苗和传播阻断疫苗 ,其中一些候选疫苗已进入临床试验 ,并产生有意义的结果。由于疟原虫具有复杂的生活史、抗原变异和多种入侵途径 ,有效疫苗的研制将面临极大的困难 。
- 潘卫庆
- 关键词：疟疾疫苗红内期疟原虫
- 恶性疟原虫重组蛋白HGXPRT免疫原性及免疫保护作用的研究被引量：3
- 2006年
- 目的探讨在毕赤酵母中表达的恶性疟原虫重组蛋白次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGX-PRT)诱导小鼠产生的免疫原性和免疫保护作用。方法35只BALB/c小鼠随机分为HGXPRT+ISA720实验组、HGXPRT+福氏佐剂试验组、ISA720对照组、福氏佐剂对照组和空白对照组等5组。HGXPRT(50μg/200μl)经小鼠后腿皮下免疫3次,间隔3周。每次免疫后2周尾静脉采血,ELISA检测血清特异性抗体水平。以间接免疫荧光试验(I-FAT)分析免疫血清对恶性疟原虫天然抗原的识别情况。于末次免疫后10d,各组小鼠经腹腔攻击感染约氏疟原虫致死株105个,继而每隔1d采尾血制薄血片,观察原虫感染的动态变化。结果重组蛋白HGXPRT经与佐剂乳化后免疫的小鼠均诱导出针对HGXPRT的体液免疫应答,3次免疫后血清中特异性抗体滴度达到1∶105以上,而两佐剂组和空白对照组小鼠均未产生特异性抗体。经HGXPRT诱导血清能识别恶性疟原虫天然HGXPRT抗原。经约氏疟原虫致死株攻击感染后4d,两佐剂对照组和空白对照组疟原虫感染高峰相比实验组提前1d。HGXPRT+ISA720实验组平均原虫率(29.3%)明显低于ISA720对照组(70.0%)和空白对照组(70.0%)(P<0.05);HGXPRT+福氏佐剂实验组平均原虫率(51.0%)亦明显低于福氏佐剂对照组(60.7%)与空白对照组(70.0%)(P<0.05)。结论恶性疟原虫重组蛋白HGXPRT对小鼠有较强的免疫原性,产生的抗体能识别恶性疟原虫HGXPRT天然蛋白,并对疟原虫攻击感染后的小鼠有一定免疫保护作用。
- 肖景莹张冬梅蔡连顺沈璐辉潘卫庆
- 关键词：恶性疟原虫毕赤酵母免疫原性约氏疟原虫
