国家自然科学基金(81171899)
- 作品数：6 被引量：18H指数：2
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- EZH2基因RNAi慢病毒载体的包装及鉴定
- 2014年
- 目的 外周T细胞淋巴瘤（PTCL）源于成熟的胸腺后淋巴细胞,是一类少见的生物学行为及临床表现均高度异质性的疾病,且预后差.包装zeste基因增强子同源物2（EZH2）RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,可为今后相关实验研究奠定基础.方法 靶向EZH2基因的短发夹RNA（EZH2-shRNA）质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装.病毒载体感染Hut78细胞后,观察感染效率,并用反转录定量PCR（RT-qPCR）和Western Blot检测EZH2mRNA和蛋白表达水平.结果 成功包装了慢病毒表达载体,对Hut78细胞的感染效率在95％以上.RT-qPCR和Western Blot检测结果显示,EZH2基因在靶细胞中的表达水平降低.结论 成功包装并鉴定了EZH2基因RNAi慢病毒表达载体.
- 陈青青杨冰赵秀娟马芹刘超梁绍平闵琦吴少华孟歆怿王玺王华庆张会来
- 关键词：外周T细胞淋巴瘤慢病毒载体RNA干扰
- 肿瘤发生的表观遗传学:进展与临床意义被引量：13
- 2012年
- 表观遗传（epigenetics）指所有不通过DNA序列改变就能影响基因表达（从而决定细胞乃至个体表型）的、可遗传的（即可伴随细胞分裂传递下去）调控方式,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、miRNA、朊病毒等。表观遗传调控在干细胞自我更新、定向分化、器官发育等生命过程中起着至关重要的作用：
- 王先火赵秀娟邱立华王华庆王玺
- 关键词：表观遗传肿瘤DNA甲基化组蛋白修饰
- ERT2-Cre诱导的Rosa26R-YFP报告基因系统标记小鼠造血干祖细胞的条件和效率检测
- 2014年
- 目的 探索ERT2-Cre诱导的黄色荧光蛋白（YFP）报告基因系统标记小鼠造血干祖细胞的条件和效率.方法 通过基因型分型的方法,从Rosa26R-YFP小鼠与ERT2-Cre小鼠杂交得到的后代中,筛选出YFP及ERT2-Cre双阳性转基因杂交小鼠;采用免疫磁珠法从双阳性转基因小鼠骨髓细胞中富集c-kit＋造血干祖细胞群进行体外培养,并用不同浓度4-羟基它莫西芬（OHT）作用不同时间以诱导YFP表达;流式细胞术检测c-kit＋造血干祖细胞中YFP的表达量.结果 Rosa26R-YFP小鼠与ERT2-Cre小鼠的杂交后代共9只,采用基因型分型方法筛选出双阳性转基因小鼠5只;体外培养的c-kit＋细胞部分形态发生变化,提示存在细胞分化;流式细胞术检测到c-kit＋细胞中YFP表达量可达13.7％.结论 YFP报告基因系统在OHT诱导的ERT2-Cre作用下,能有效标记小鼠造血干祖细胞.
- 罗琦尹洁孟歆怿杨冰雷蕾孙琰李丹丹王瑾王玺何景华
- 关键词：造血系统造血干祖细胞
- 人脐带血造血干细胞体外分化为NK细胞的效率及功能检测被引量：3
- 2015年
- 目的检测人脐带血造血干细胞(HSCs)体外分化为自然杀伤(NK)细胞的效率及功能。方法从人脐带血中分离CD34+HSCs,接种于含20μg/L FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、干细胞生长因子(SCF)、白细胞介素(IL)-7、IL-15及IL-21的SCGM培养基中,定向诱导CD34+HSCs分化为NK细胞。观察细胞生长状态,在分化的第7、14、21及28天,采用流式细胞术检测各阶段CD56、NKG2D、NKp46、CD3、CD19及CD34等细胞免疫表型的表达变化;分化的第21、28天,以分化得到细胞为效应细胞,K562细胞作为靶细胞,设置8∶1、4∶1、2∶1和1∶1 4组效靶细胞比,分别采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测法和7AAD/CFSE标记法,检测分化得到的细胞杀伤功能。结果脐带血来源的CD34+HSCs在体外适宜的条件下可大量增殖;整个分化进程的不同阶段中,CD3和CD19表达量差异无统计学意义,CD56、NKG2D及NKp46的表达量逐渐增加,最高达(72.57±1.60)%、(32.83±1.29)%和(29.53±2.40)%,CD34的表达量逐渐降低,最低为(12.13±2.01)%。LDH毒性检测法和7AAD/CFSE标记法测得最大杀伤效率可达(49.91±2.76)%和(40.87±1.12)%,8∶1、4∶1、2∶1和1∶1组NK细胞杀伤能力均依次降低(P<0.05),诱导分化28 d的NK细胞杀伤能力与21 d差异无统计学意义。结论人脐带血HSCs在体外适宜的培养条件下,可定向分化为NK细胞,诱导分化得到的NK细胞具有杀伤功能。
- 罗琦尹洁李杨黄珊王玺何景华
- 关键词：造血干细胞免疫表型分型免疫CD34^+HSCS体外分化
- 利用CRISPR/Cas9n系统敲除人源SNF5基因被引量：1
- 2015年
- 目的:建立敲除人源基因组中SNF5基因的CRISPR/Cas9n系统。方法:设计一对靶向人源SNF5基因第1个外显子的sg RNA,分别克隆至p X461、p X462表达载体后,转入人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测细胞株中SNF5基因的敲除效果。结果:测序证明构建的靶向SNF5基因CRISPR/Cas9n重组质粒与设计吻合。Western印迹结果显示,重组质粒p X461-h SNF5sg RNA转染293T细胞后24 h,细胞内SNF5表达水平明显降低;重组质粒p X462-h SNF5sg RNA转染293T细胞后48 h,细胞内SNF5表达水平显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9n系统获得了靶向SNF5基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除SNF5基因的表达。
- 孙琰刘超毛赟赟王玺
- 关键词：表观遗传
- Vav-Cre介导的YFP报告基因系统标记小鼠NK细胞的特异性和效率检测被引量：1
- 2014年
- 目的探索Vav-Cre介导的黄色荧光蛋白(YFP)报告基因系统标记小鼠体内自然杀伤(NK)细胞的特异性和效率。方法通过基因型分型筛选ROSA26R-YFP与Vav-Cre小鼠杂交后代中双阳性基因型小鼠,流式细胞术分析免疫器官淋巴结、脾、胸腺以及骨髓细胞的YFP表达效率,通过细胞表面抗体标记淋巴结、脾及骨髓的NK细胞,流式细胞术分析NK细胞群体中YFP阳性细胞百分比。结果 ROSA26R-YFP与Vav-Cre小鼠杂交后代共17只,双阳性基因型小鼠(ROSA26R-YFP(+/-)Vav-Cre)11只;流式细胞术分析淋巴结、脾、胸腺、骨髓细胞中YFP阳性细胞的百分比(%)分别为73.87±1.51、56.07±1.47、86.17±1.74、53.60±3.56,阴性对照组相应器官分别为0.27±0.01、1.33±0.91、0.11±0.01,0.29±0.03,差异有统计学意义(均P<0.01),两种类型小鼠非免疫器官肾中均无明显YFP表达(双阳性鼠0.72%±0.43%,对照鼠0.92%±0.27%,P>0.05);淋巴结、脾和骨髓中NK细胞YFP阳性百分比(%)76.94±0.84、81.66±1.18、88.92±0.77,与阴性对照组比较均明显增高(均P<0.01)。结论 Vav-Cre介导的YFP报告基因系统标记小鼠体内NK细胞具有特异性及高效性。
- 李丹丹孟歆怿雷蕾尹洁王玺张玲
- 关键词：黄色荧光蛋白CRE重组酶
