湖北省自然科学基金(2010CDZ046)
- 作品数：6 被引量：7H指数：2
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- 链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定
- 2012年
- 将酵母胞内表达质粒pPIC3.5k重组成带有谷氨酰胺转胺酶的新型表达载体pPIC3.5k/MTG,为谷氨酰胺转胺酶(MTG)在毕赤酵母中的表达研究提供了实验基础.利用PCR的方法扩增出MTG基因片段,将目的片段和质粒pPIC3.5k进行双酶切后进行连接,构成重组质粒,然后转化至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,经测序证明为目的基因片段.结果表明:经过PCR和酶切均证明已经将目的片段转到酵母表达载体pPIC3.5k内.
- 何冬兰王亚南邵坤彦叶程
- 关键词：谷氨酰胺转胺酶
- 重叠延伸PCR法定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶基因被引量：4
- 2013年
- 目的通过重叠延伸PCR法,定点突变微生物产谷氨酰胺转氨酶(Microbial transglutaminase,MTG)基因。方法根据GenBank中登录的Streptomyces sp.H197基因中MTG序列及重叠延伸PCR定点突变技术的原理,利用DNA-MAN5.0软件设计引物,以提取的Streptomyces sp.H197基因组DNA为模板,PCR扩增MTG基因,以扩增的MTG基因片段为模板,采用重叠延伸PCR技术对一个位点进行定点突变,胶回收PCR产物,与克隆载体pMD19-T连接后,转化感受态E.coli DH5α,提取质粒,经PCR及单、双酶切鉴定,并测序。结果重叠延伸PCR产物可见含有酶切位点和突变位点的特异性片段;重组质粒pMD19-T-MTG经PCR及单、双酶切鉴定,证明构建正确;测序结果表明,与野生型序列比对,仅有一个碱基发生改变,即第773位腺嘌呤突变为胞嘧啶,突变位点与预期一致,实现了目标位点的定点突变。结论重叠延伸PCR法对MTG基因序列预定位点突变成功,证明阳性克隆子含突变位点,为下阶段突变型功能表达奠定基础。
- 叶程邵坤彦王亚南覃桂代风娇何冬兰
- 关键词：谷氨酰胺转氨酶点突变
- 微生物谷氨酰胺转胺酶的乳糖诱导表达与纯化被引量：1
- 2012年
- 对已构建的工程菌株pET22b-MTG/E.coli BL21(DE3)进行质粒酶切和PCR鉴定,优化诱导温度、时间、pH和乳糖浓度等反应条件,采用乳糖自诱导培养基培养重组菌.并将重组菌上清液经凝胶过滤,离子交换及镍柱亲和层析后,对谷氨酰胺转胺酶纯化和SDS-PAGE电泳分析.结果表明:谷氨酰胺转胺酶在28℃,添加乳糖为1.2g/L诱导18 h,pH为7.0,培养11.5 h时升温至50℃诱导1 h,再放至28℃培养,表达效果较好,超过IPTG诱导效果.纯化后酶活为7.5 U/mL,比活力为10.9 U/mg.
- 何冬兰邵坤彦叶程黄俊尚敏邦
- 关键词：谷氨酰胺转胺酶乳糖纯化
- 谷氨酰胺转胺酶在毕赤酵母菌的初步表达
- 2013年
- 从重组菌株pPIC3.5k-MTG/DH5α提取重组质粒pPIC3.5k-MTG,经Sac I酶切线性化处理后纯化重组质粒电击转化到毕赤酵母菌中,用甲醇诱导表达,经SDS-PAGE鉴定重组质粒P.pastoris GS115成功表达出了TGase蛋白,并初步纯化获得了较纯的目的蛋白,其表观分子量为47 kD,酶活为0.50 U/mL.
- 何冬兰叶程王亚南覃桂
- 关键词：谷氨酰胺转胺酶毕赤酵母
- 谷氨酰胺转胺酶基因的结构分析及定点突变
- 2015年
- 根据分离得到的吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因,预测其三维结构,确定其酶活中心,并构建定点突变体。用PCR扩增谷氨酰胺转胺酶基因,通过SWISS-MODEL在线预测三维结构,找到酶活中心,确定突变位点,将361位的组氨酸(CAC)突变成赖氨酸(AAA),将突变后的基因片段连接到pET-22b(+)上得到重组质粒pET-22b(+)-MTG,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。结果显示,通过对比已有的三维结构模型,找到了酶活中心,并通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术成功构建了突变体。
- 代风娇詹锐覃桂万文杰何冬兰
- 关键词：谷氨酰胺转胺酶定点突变
- 重组谷氨酰胺转胺酶的表达、复性及纯化被引量：2
- 2013年
- 以吸水链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因片段,构建pGEX-TGase重组质粒,并转化到大肠杆菌中得到重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,并对诱导条件进行了优化。表达产物主要以包涵体形式存在,采取稀释及尿素梯度液相色谱结合的方法,成功地实现了包涵体蛋白的复性。通过GST亲和柱纯化目的蛋白,得到酶活为29U/mg的电泳纯目的蛋白。
- 邵坤彦彭宝玉叶程刘威何冬兰
- 关键词：谷氨酰胺转胺酶乳糖诱导包涵体蛋白纯化复性
