国家自然科学基金(30960412)
- 作品数：10 被引量：11H指数：2
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- P21对HoxB4的调控机制及其影响造血干细胞增殖初步研究被引量：1
- 2018年
- 目的:利用转基因斑马鱼模型探讨P21是否作为Hox B4的下游基因参与调控造血干细胞(HSC)的增殖发育。方法:转基因斑马鱼系Tg(z Lmo2:LDe L-Hox B4-EGFP)与Tg(z Lmo2:Cre)交配后的胚胎作为Hox B4实验组、Tg(z Lmo2:LDe L-EGFP)与Tg(z Lmo2:Cre)交配后的胚胎作为EGFP对照组、野生型斑马鱼胚胎作为空白对照组,利用P21反义mRNA探针对斑马鱼全胚胎进行原位杂交,观察P21的表达情况。结果:Hox B4实验组胚胎、EGFP实验对照组胚胎及空白对照组胚胎在时相为18 hpf、24 hpf、72 hpf时原位杂交结果未见明显区别,30 hpf及36 hpf的Hox B4实验组斑马鱼胚胎脊椎部位P21的表达发生少量下调,48 hpf的Hox B4实验组、EGFP对照组两组胚胎胸腺部位P21较空白对照组发生少量下调。结论:转基因过表达Hoxb4的斑马鱼在造血细胞增殖异常旺盛的情况下,P21表达量出现下降,提示在胚胎期造血发育过程中P21可能作为Hox B4的下游基因,并通过Hox B4负调控作用来参与调节HSC的增殖发育。
- 李雪华姬牧远周艳华何志旭何志旭
- 关键词：造血干细胞斑马鱼转基因细胞增殖P21HOXB4
- Rap1基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的时空表达谱研究
- 2016年
- 目的选择斑马鱼作为实验动物模型，研究Rap1基因在胚胎早期发育过程中的时空表达规律。方法从斑马鱼胚胎cDNA中克隆Rap1基因片段，将Rap1基因片段和pCS2＋质粒进行体外连接重组，重组质粒经双酶切、菌落聚合酶链反应（PCR）及测序鉴定正确后，经T3RNA体外转录体系合成DIG标记的Rap1基因反义mRNA探针，采用整胚原位杂交方法检测Rap1在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达情况。结果在斑马鱼胚胎0．75hpf的细胞分裂连接处、3．70hpf和6．00hpf的动物极、12．00～72．00hpf的脊索神经部位均可见Rap1基因的阳性杂交信号。结论Rap1基因在斑马鱼脊索神经系统的早期发育过程中可能起到重要的调控作用。
- 杨小燕何志旭舒莉萍金皎黄璟吴莎莎马健娟
- 关键词：斑马鱼原位杂交
- 斑马鱼cdh5基因的克隆与鉴定被引量：2
- 2014年
- 目的:克隆并鉴定斑马鱼cdh5基因,为研究cdh5在血管生成和造血发育中的作用奠定基础。方法:收集斑马鱼胚胎,提取斑马鱼全胚胎的总RNA,经体外逆转录制备成cDNA,通过RT-PCR方法克隆斑马鱼cdh5基因,克隆出的目的片段通过酶切和测序进行鉴定。结果:成功提取符合实验要求的斑马鱼总RNA,并克隆出cdh5全长,测序后比对正确。结论:成功克隆cdh5全长序列。
- 吴西军何志旭舒莉萍
- 关键词：斑马鱼基因克隆造血干细胞
- 胚胎干细胞来源的微囊体分离提取及促造血作用的观察
- 2013年
- 目的探讨分离提取及鉴定胚胎干细胞(ESC)产生的微囊体(MV)的实验方法,初步研究其促造血的生物学作用。方法利用超滤离心的方法从小鼠ESC培养上清液中分离提纯MV(ES-MV),以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养上清来源的MV(MEF-MV)为对照;采用透射电镜形态学观察,RT-PCR检测特异性基因表达的方法对ES-MV进行鉴定;将ES-MV用于环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠,通过骨髓涂片初步观察其对造血的恢复作用。结果透射电镜下观察,ES-MV呈明显异质性的圆形或椭圆形小囊泡,直径约30 nm-1μm不等,有完整的包膜,内为低电子密度物质。RT-PCR方法从ES-MV中可检测到Oct-4、Wnt-3、Hoxb4基因的表达,而MEF-MV内不能检测到这些基因的表达;将ES-MV用于骨髓抑制小鼠后,骨髓涂片显示成熟红细胞和有核细胞比例明显升高。结论 ESC可以产生MV,并且是MV的丰富来源;超滤离心法是一种方便实用的提取ES-MV的方法;ES-MV对促进骨髓造血有一定的作用。
- 何志旭李色舒丽萍
- 关键词：胚胎干细胞
- pCS^(2+)-FLASH重组质粒的构建及斑马鱼FLASH基因反义mRNA探针的制备被引量：2
- 2010年
- 目的构建斑马鱼pCS2+-FLASH重组质粒,制备斑马鱼FLASH反义mRNA探针。方法提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼FLASH基因片段,将得到的FLASH片段和pCS2+质粒用BamHⅠ及HindⅢ双酶切后插入pCS2+质粒,通过对重组质粒进行双酶切及插入片段序列测序鉴定后,经T3RNA体外转录体系合成DIG-FLASH基因反义mRNA探针。结果RT-PCR法扩增出长度为533bp的特异性产物,构建的pCS2+-FLASH重组质粒经酶切鉴定和测序结果与预期相符;用FLASH反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观察到FLASH在野生型斑马鱼神经系统中存在表达。结论成功构建了pCS2+-FLASH重组质粒及FLASH基因反义mRNA探针。
- 丁可军何志旭舒莉萍许威姬牧远杨小燕
- 关键词：斑马鱼FLASH
- Pax5基因在野生型斑马鱼全胚胎发育早期的表达被引量：1
- 2012年
- 目的为了深入了解在胚胎发育过程中,尤其是在早期B淋巴细胞的生成和中脑的发育过程中pax5基因可能的作用及其机制,选择斑马鱼作为实验动物,构建野生型斑马鱼pCS2+-pax5重组质粒,并观察pax5基因在野生型斑马鱼胚胎中的表达。方法提取斑马鱼胚胎总RNA后经RT-PCR克隆斑马鱼pax5基因片段,将得到的pax5基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后,在T4DNA连接酶的作用下插入pCS2+质粒中,通过对重组质粒进行双酶切、菌落PCR以及插入片段序列测定鉴定后,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的pax5基因的反义mRNA探针。将得到的探针用全胚胎原位杂交技术检测pax5基因在斑马鱼早期发育过程中的表达。结果成功构建pCS2+-pax5重组质粒并制备了pax5基因的反义mRNA探针,通过斑马鱼原位杂交技术,发现在斑马鱼受精后18～72小时(18～72hpf)胚胎头部的小脑、中脑后脑交界处均可观察到pax5基因阳性杂交信号;在24～72hpf胚胎的耳蜗均可观察到pax5基因的阳性杂交信号,且随着时相的增长其表达逐渐增多;在18～48hpf胚胎的脊索部位可见pax5基因的阳性杂交信号。结论明确了pax5基因在斑马鱼胚胎的脑部、脊索神经系统高表达,并首次证实其在耳蜗听神经的早期发育过程中有表达,可能对斑马鱼早期胚胎神经系统的发育起着某些至关重要的作用。
- 姚冬静舒莉萍何志旭马建娟李涛黄惠敏
- 关键词：斑马鱼原位杂交
- HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达被引量：1
- 2013年
- 目的探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础。方法提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交。结果构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达。结论得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础。
- 马健娟何志旭舒莉萍姚冬静李莉李燕
- 关键词：斑马鱼原位杂交
- p21基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达被引量：1
- 2016年
- 目的:探究p21基因在斑马鱼早期发育过程中的表达。方法:Trizol法提取野生型斑马鱼胚胎总RNA,RT-PCR法扩增p21基因片段,与p^(CS2+)载体重组构建p21-p^(CS2+)重组质粒,以T3 RNA聚合酶制备地高辛标记的反义mRNA探针,通过斑马鱼全胚胎原位杂交检测p21基因在野生型斑马鱼胚胎早期发育过程中的表达。结果:成功构建了p21-p^(CS2+)重组质粒,并制备反义mRNA探针;原位杂交结果显示野生型斑马鱼0.5~18 hpf的胚胎均未发现p21基因阳性杂交信号,24~36 hpf胚胎可在脊索部位观察到阳性信号,48~72 hpf胚胎可在头部胸腺附近观察到阳性信号,表达量均较低。结论:成功制备了p21-p^(CS2+)重组质粒及斑马鱼p21基因反义mRNA探针,p21基因在野生型斑马鱼胚胎不同发育时相中表达水平不同。
- 宋锦姬牧远吴西军周艳华舒莉萍何志旭
- 关键词：P21斑马鱼
- 野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱被引量：3
- 2012年
- 目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。
- 舒莉萍何志旭姚冬静马健娟李涛叶芝旭
- 关键词：寡核苷酸类斑马鱼
- 基于CRISPR/Cas9系统对斑马鱼hoxb4基因的编辑及其突变体基因型的初筛
- 2015年
- 采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9构建hoxb4基因敲除斑马鱼模型,进行hoxb4基因功能的研究。根据hoxb4基因的一号外显子的正义链及反义链设计3个长20 bp的sg RNA,分别靶向ExonⅠ的192#位点,244#位点及313#位点。化学合成sg RNA的寡核苷酸序列,经过酶切克隆进p T7-g RNA质粒中,构建g RNA的体外转录载体并通过体外转录得到靶位点的g RNA。将质粒p SP6-2s NLS-sp Cas9线性化然后在体外转录得到Cas9的m RNA并进行加A尾,将以上靶位点的g RNA与Cas9的m RNA共注射入单细胞期的斑马鱼胚胎内,提取基因组DNA,PCR扩增出目的基因片段并使用T7EI酶切测效,最后将PCR产物连入p MD19-T simple载体中,挑取阳性克隆进行菌落PC R鉴定,然后经Sanger测序检测突变类型。结果显示,靶位点的sg RN A寡核苷酸双链成功连入p T7-g RNA质粒中且序列正确;其中靶向ExonⅠ的313#位点的sg RNA可成功编辑斑马鱼hoxb4基因,T7 EⅠ检测其敲除效率高达26.5%,并测序得到4种阳性突变型。通过CRISPR/Cas9系统成功编辑斑马鱼hoxb4基因并测序鉴定其突变类型,为HOXb4基因功能的研究提供了可靠的基因敲除方法。
- 袁梦何志旭舒莉萍袁家侃刘丰李燕
