卫生部科学研究基金(WKJ2004-2-001)
- 作品数：7 被引量：12H指数：2
- 相关作者：李德春张克君朱东明朱兴国谢于更多>>
- 相关机构：苏州大学中国人民解放军总医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人端粒酶逆转录启动子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗裸鼠胰腺移植瘤的安全性研究被引量：1
- 2007年
- 目的探讨人端粒酶逆转录(hTERT)启动子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV- TK)基因治疗裸鼠胰腺癌的安全性。方法应用细菌内同源重组法构建hTERT启动子和常规巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的HSV-TK基因真核表达载体PDC312-TP-TK,PSU-CMV-TK。制备腺病毒液,检测病毒滴度为1.9×10^(10)pfu/ml和1.4×10^(10)pfu/ml。建立裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型,分别以两种方法治疗后观察皮下移植瘤消退、HSV-TK基因表达情况、肝脏苏木素-伊红(HE)染色切片、肝功能。结果PDC312-TP-TK组与PSU-CMV-TK组对肿瘤的抑瘤率分别为58.3%和65.6%,治疗组间差异无统计学意义(P>0.05),杀伤方面具有一样的高效性;但其对肝脏的毒副作用远小于PSU-CMV-TK组,PDC312-TP-TK组血清中ALT,AST,ALP分别为(54.00±1.97)、(147.00±12.67)、(33.00±2.59)U/L而PSU-CMV-TK组中为(334.00±9.81)、(511.00±11.24)、(98.00±3.12)。差异有统计学意义(P<0.01)。裸鼠肝脏苏木素-伊红(HE)染色中,仅PSU-CMV-TK组有肝脏坏死改变。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)中也仅PSU-CMV-TK组检测到1143 bp的TK基因片段。结论hTERT启动子驱动的HSV-TK基因是一种新的靶向治疗方法,在具有治疗高效性的同时,更具有安全性。
- 谢于李德春张子详朱兴国王凤力
- 关键词：端粒酶启动子基因治疗
- hTERT启动子驱动的HSV-TK基因对人胰腺癌细胞patu8988的杀伤作用被引量：1
- 2009年
- [目的]探讨hTERT启动子驱动的HSV-TK基因对人胰腺癌细胞patu8988的杀伤作用。[方法]应用分子生物学方法构建hTERT启动子调控下的TK基因真核表达载体。经同源重组产生重组腺病毒PSG-TP-TK。同法制备PSU-CMV-TK。利用重组腺病毒PSG-TP-TK和PSU-CMV-TK感染人胰腺癌细胞株patu8988和正常人原代成纤维细胞,加入GCV。用MTT和流式细胞仪检测PSG-TP-TK对各种细胞的杀伤作用;应用RT-PCR检测转染腺病毒后肿瘤细胞和正常细胞中TK基因的表达情况。[结果]PSG-TP-TK对端粒酶阳性的人胰腺癌细胞有明显的杀伤作用,而对端粒酶阴性的正常细胞则无杀伤作用(P<0.05)。hTERT启动子诱导人胰腺癌细胞株patu8988凋亡的效能与CMV启动子相似,两者差异无显著性(P>0.05)。PSU-CMV-TK转染后,在patu8988细胞和正常人原代成纤维细胞中均可检测到TK基因;而PSG-TP-TK转染后只有patu8988细胞中有TK基因表达,正常人原代成纤维中则无。[结论]hTERT启动子驱动HSV-TK基因治疗是一种新的胰腺癌靶向治疗方法,具有更高的靶向性和高效性。
- 谢于董家鸿朱兴国李德春
- 关键词：人端粒酶逆转录酶启动子单纯疱疹病毒胸苷激酶基因
- NF-κBp65、Bcl-2、Bcl-xL蛋白在胰腺癌中的表达及其与P53和凋亡指数的关系被引量：7
- 2007年
- 背景与目的:核因子κB通过调控下游bcl-2家族基因表达参入细胞凋亡调节过程,而p53除了参入细胞周期调节外也参入依赖bcl-2基因的细胞凋亡调控。在胰腺癌中NF-κBp65、Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达与p53和凋亡的关系还不清楚。本研究系统地分析了核因子κBp65及其下游的bcl-2和bcl-xL抑凋亡基因在胰腺癌(PC)中的表达以及与P53蛋白表达和凋亡指数(AI)的关系。方法:免疫组化法检测25例胰腺导管腺癌(PC)和9例正常胰腺组织(NP)中P53蛋白表达;Western印迹法分析NF-κBp65蛋白表达;RT-PCR分析Bcl-2和Bcl-XL蛋白表达,TdT酶介导的原位缺口标记(TUNNEL)法了解胰腺癌细胞凋亡情况(AI)。结果:P53在PC组织阳性率(56%,14/25),高于NP组织阳性率(P<0.00);NF-κBp65、Bcl-2和Bcl-xL在PC组织表达相对值分别为:1.06±0.16、0.79±0.13、0.76±0.24,分别高于NP组织:0.23±0.016、0.23±0.074、0.18±0.026(分别P<0.05);14例p53阳性PC中,NF-κBp65、Bcl-2和Bcl-Xl表达相对值分别为:1.32±0.23、0.92±0.33、0.82±0.21;11例p53阴性PC中,NF-κBp65、Bcl-2和Bcl-xL表达相对值分别为:0.78±0.15、0.54±0.19、0.71±0.28(分别P<0.05,P<0.05,P>0.05);NF-κBp65和Bcl-2分别与P53表达有明显的正相关性(分别P<0.01,P<0.05),Bcl-xL与P53无相关性(P>0.05),NF-κBp65与Bcl-XL表达正相关(P<0.01),而NF-κBp65与Bcl-2表达无相关性(P>0.05);胰腺癌平均AI为(15.4±6.48)%,NF-κBp65表达与AI负相关(r=-0.297,P<0.05),而Bcl-2、Bcl-xL与AI无相关性(r=-0.203,P>0.05;r=-0.156,P>0.05)。结论:胰腺癌中抗凋亡因子表达上调,凋亡指数主要决定于NF-κBp65蛋白水平;NF-κBp65通过对下游bcl-xL基因表达的调控参与胰腺癌凋亡过程;p53在凋亡调节过程中起重要作用。
- 张克君李德春朱东明
- 关键词：胰腺癌BCL-2P53凋亡指数
- PUMA基因转染胰腺癌AsPC-1细胞增强对5-FU致凋亡的敏感性被引量：3
- 2008年
- 目的：探讨PUMA基因转染是否增强胰腺癌AsPC-1细胞对5-FU致凋亡的敏感性。方法：采用脂质体转染法将PUMA-pCEP4和空载体pCEP4质粒转染入胰腺癌AsPC-1细胞中,G418筛选阳性细胞。将系列浓度（0.01～100μmol/L）的5-FU分别作用于AsPC-1、AsPC-1/PUMA和AsPC-1/pCEP4细胞72h,MTT法测定各组细胞的存活率并计算IC50,FCM、断裂DNA琼脂糖凝胶电泳和TUNEL法检测细胞凋亡情况,Western blotting检测各组细胞PUMA蛋白表达的变化。结果：AsPC-1、AsPC-1/PUMA和AsPC-1/pCEP4细胞的5-FUIC50分别为（12±1.9）、（1.6±0.4）和（10.4±1.6）μmol/L,AsPC-1/PU-MA细胞对5-FU作用的敏感性增加了7.5倍。5-FU以剂量依赖方式诱导AsPC-1细胞凋亡,但对AsPC-1/PUMA细胞所诱导的凋亡比AsPC-1和AsPC-1/pCEP4更明显。低浓度5-FU（0.1μmol/L）轻微引起AsPC-1/pCEP4[（1.14±0.28）%]和AsPC-1细胞凋亡[（0.9±0.23）%],但能诱导AsPC-1/PUMA细胞明显凋亡[（6.47±1.42）%];高浓度5-FU（1μmol/L）诱导各组细胞凋亡,但AsPC-1/PUMA细胞凋亡率[（34.54±9.36）%]明显高于AsPC-1[（12.8±3.74）%]和AsPC-1/pCEP4细胞[（15.8±5.15）%],差异均有统计学意义（P〈0.01）;FCM、断裂DNA琼脂糖凝胶电泳和TUNEL方法检测显示相同的结果。PUMA蛋白在AsPC-1/PUMA细胞中的表达明显高于AsPC-1和AsPC-1/pCEP4细胞。结论：PUMA基因转染明显地增强了胰腺癌AsPC-1细胞对5-FU致凋亡作用的敏感性。
- 张克君李德春朱东明
- 关键词：PUMA基因胰腺癌5-FU凋亡
- 携带内皮抑素复制缺陷型腺病毒载体的构建及其应用
- 2005年
- 目的构建鼠源性内皮抑素(mEndostatin)重组腺病毒真核表达载体,并将其转染胰腺癌细胞株,探讨其体外抑制血管形成的活性。方法 以mEndostatin质粒为模板通过PCR方法扩增回收mEndostatin,将mEndostatin连接到腺病毒载体pCA13中,构建pCA13-mEndo表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒pBGHE3通过lipofectamine 2 000共同转染293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-mEndo,用氯化铯密度梯度超速离心法纯化,用50％组织培养感染剂量法测定病毒滴度。体外转染胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3,并测定感染的胰腺癌细胞上清液mEndostatin的表达及观察其抑制血管形成的活性。结果 扩增得到的mEndostatin经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序证实为鼠源性内皮抑素,重组腺病毒Ad-mEndo的滴度为6.3×1010pfu／ml,体外能高效转染胰腺癌细胞株,可分泌表达有抑制血管形成活性的mEndostatin。结论本实验所构建的mEndostatin重组腺病毒表达载体能有效表达具有生物活性的mEndostatin,为体内胰腺癌的基因治疗奠定了基础。
- 张子祥李德春赵华朱新国
- 关键词：内皮抑素胰腺癌
- 重组腺病毒介导的野生型PUMA基因对胰腺癌细胞的放射增敏作用
- 2007年
- 文献报道，PUMA基因转染可促进体外肺癌和食管癌细胞凋亡，并能增强它们对放化疗的敏感性。我们曾将野生型PUMA转染胰腺癌Aspc-1细胞，发现Aspc-1细胞的生长明显被抑制。本实验旨在研究转染野生型PUMA基因的胰腺癌Aspc-1细胞是否增强其对放疗的敏感性。
- 张克君李德春朱东明宋彩霞
- 关键词：胰腺癌细胞转染野生型重组腺病毒介导放射增敏作用ASPC-1
- 内皮抑素重组腺病毒载体的构建及制备被引量：1
- 2004年
- 目的 构建鼠源性内皮抑素(mEndostatin)重组腺病毒真核表达载体,为下一步研究其在体外表达及动物实验研究提供基础。方法 以mEndostatin质粒为模板通过PCR方法扩增回收mEndostatin,并在其5'端引入M-成瘤蛋白信号肽。将mEndostatin连接到腺病毒载体pCA13中,构建pCA13-mEndo表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒pBGHE3通过Lipofectamine 2000共同转染293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-mEndo。纯化后重组腺病毒Ad-mEndo在293细胞大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度。结果 扩增得到的mEndostatin经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序证实为鼠源性内皮抑素,重组腺病毒Ad-mEndo的滴度为6.3×1010 pfu／ml。结论 该实验为今后研究重组腺病毒mEndostatin用于恶性肿瘤的基因治疗打下了基础。
- 张子祥李德春赵华朱兴国
- 关键词：内皮抑素腺病毒真核表达
