山东省医药卫生科技发展计划项目(2009HD005)
- 作品数：5 被引量：3H指数：1
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- 相关机构：青岛大学青岛大学医学院附属医院更多>>
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- 重组大肠埃希菌-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1-eIL-12稳定转化生孢梭菌
- 2012年
- 目的近些年来,以厌氧芽孢梭菌作为实体瘤基因治疗载体的研究逐渐受到关注。文中用重组人白细胞介素-12(rhIL-12)基因重组大肠埃希菌(E.coli)-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1,并稳定转化生孢梭菌,为增强杀伤肿瘤细胞的研究提供基础。方法用SOE-PCR法将rhIL-12基因连到厌氧梭菌的内源性β1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-glucanase,eglA)启动子和信号肽之后,构建融合基因eglAp-rhIL-12,将其插入pIMP1,构建重组质粒pIMP1-eIL-12;重组质粒首先在E.coli DH5α内进行鉴定,然后用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,并提取质粒鉴定阳性克隆。结果酶切和测序结果表明插入到pIMP1内的融合基因eglAp-rhIL-12序列及读框正确;抗生素压力筛选和20多代随机质粒提取酶切鉴定结果表明重组质粒pIMP1-eIL-12已稳定转化生孢梭菌。结论成功获得重组质粒pIMP1-eIL-12及其生孢梭菌稳定转化株,为以后的抗肿瘤研究奠定了基础。
- 张艳丽张文卿王秋波丁守怡吕锐孟林
- 生孢梭菌作为肿瘤基因治疗载体应用方式与动态分布被引量：1
- 2013年
- 目的探讨生孢梭菌在乳癌小鼠体内的应用方式与动态分布,为实体瘤治疗中生孢梭菌的具体应用提供参考。方法制备小鼠乳癌模型。取生孢梭菌的芽胞和繁殖体,以尾静脉和瘤内注射两种方式注射到乳癌小鼠体内,定期随机选取小鼠,处死后取其肝、肾、脾等重要器官以及肿瘤组织制作印片,经革兰染色后镜下观察。同时取组织匀浆进行厌氧培养,观察不同时期组织内细菌分布情况。结果生孢梭菌的繁殖体与芽胞一样可以在低氧的乳癌内部定居繁殖,且没有观察到明显的毒性。静脉注射后,生孢梭菌可以在肿瘤内大量繁殖,与瘤内注射的结果相同;与瘤内注射不同的是,各器官中有少量细菌分布,但随时间的推移很快被清除。生孢梭菌在肿瘤消退之前被进入肿瘤内部的中性粒细胞吞噬消除。结论生孢梭菌是一种靶向性好、安全性高、自限性的实体瘤治疗的靶向载体;在实体瘤的靶向治疗中,可以采用静脉注射的方式,随意采用生孢梭菌的繁殖体、芽胞或二者混合物作为载体将抗肿瘤基因定向送至肿瘤内部发挥作用。
- 张艳丽苏昊胡昊宇马瑞华张伟伟袁欣欣
- 关键词：繁殖体芽胞尾静脉注射瘤内注射
- IL-12修饰的生孢梭菌抗小鼠乳腺癌作用观察被引量：1
- 2014年
- 目的基于实体瘤内部普遍存在缺氧区及生孢梭菌厌氧生长的特性,利用生孢梭菌靶向递送IL-12至肿瘤部位,观察其抗肿瘤效果及其毒副作用。方法利用基因工程技术将IL-12cDNA克隆至大肠埃希菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1并转入生孢梭菌。用ELISA和Western blot分析其IL-12的表达;IFN-γ诱导试验测定其生物学活性;利用小鼠乳腺癌细胞EMT6制备小鼠肿瘤模型,尾静脉注射重组梭菌后观察其抗肿瘤效果及其毒性表现。结果 ELISA和Western blot显示重组生孢梭菌可分泌IL-12,体外与小鼠脾脏细胞共同培养可以引起IFN-γ的释放。重组生孢梭菌静脉注射到荷瘤小鼠体内后,小鼠血清IFN-γ显著增高,肿瘤萎缩。实验过程中未观察到与IL-12相关的腹泻、体重减轻和死亡等毒性作用。结论利用重组生孢梭菌生产的IL-12具有抗小鼠乳腺肿瘤作用,且没有明显毒性。
- 张艳丽张文卿王秋波丁守怡
- 关键词：IL-12抗肿瘤效果毒性
- 重组穿梭质粒pIMP1-eHER2/neu的构建及其生孢梭菌稳定转化株的筛选与鉴定
- 2011年
- 目的:制备人原癌基因HER2/neu的细胞外区域(ECD)基因修饰的重组生孢梭菌,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法:利用SOE-PCR将HER2/neu ECD基因连接到厌氧菌的内β1,4-葡聚糖酶的启动子和信号肽基因(eg-lAp)下游,构建融合基因eglAp-HER2/neu;将其插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,构建重组质粒;首先将重组质粒导入大肠杆菌DH5α内并进行鉴定;然后用电穿孔法将重组质粒导入生孢梭菌。利用红霉素抗性筛选重组生孢梭菌;采用菌液PCR鉴定阳性克隆。结果:酶切和测序结果显示,插入质粒pIMP1内的eglAp-HER2/neu融合基因序列及读框正确。菌液PCR结果表明,重组质粒pIMP1-eHER2/neu成功转化生孢梭菌;经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带pIMP1-eHER2/neu。结论:成功制备了重组质粒pIMP1-eHER2/neu生孢梭菌的稳定转化株,为其进一步的抗肿瘤作用研究奠定基础。
- 张艳丽张文卿王秋波丁守怡吕锐孟林
- 关键词：HER2/NEUECD
- hIL-12及HER2/neu ECD修饰的生孢梭菌工程菌的构建及鉴定被引量：2
- 2011年
- 目的构建人IL-12(hIL-12)基因和乳腺癌靶基因HER2/neu胞外区(ECD)分别修饰的生孢梭菌工程菌,探讨其在乳腺癌基因治疗中的作用。方法将hIL-12和HER2/neu ECD的基因分别连接到厌氧梭菌的内源性β-1,4-葡聚糖酶启动子和信号肽序列(eglAp)之后,得到融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu。将融合基因插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,得到重组质粒pIMP1-ehIL-12和pIMP1-eHER2/neu。将重组质粒首先转化大肠杆菌DH5α,通过酶切和测序鉴定无误后,再用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,采用菌液PCR和质粒提取鉴定阳性克隆,采用ELISA法对生孢梭菌培养上清中目的产物进行分析。结果酶切和测序结果表明重组质粒内的融合基因eglAp-hIL-12和eglAp-HER2/neu序列和读框正确,菌液PCR、质粒提取和ELISA结果显示hIL-12和HER2/neu ECD基因成功修饰生孢梭菌并表达。经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带和表达外源基因。结论成功获得hIL-12和HER2/neu ECD基因分别修饰的生孢梭菌工程菌株,为进一步的抗肿瘤研究奠定基础。
- 张艳丽张文卿王秋波丁守怡吕锐董海
- 关键词：HER2/NEUECD
