国家自然科学基金(30371299)
- 作品数：8 被引量：19H指数：3
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- 猿猴病毒40T抗原介导永生化黑素细胞对其核型、HLA-DR和hTERT表达的影响
- 2008年
- 目的:观察猿猴病毒40T(SV40T)抗原介导黑素细胞(melanocyte,MC)永生化对染色体核型、人白细胞抗原-DR(humanleucocyte antigen-DR,HLA-DR)和人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)表达的影响。方法:利用SV40T抗原基因和真核表达载体PEGFP,经SofastTM阳离子聚合物转染至体外培养的第4代MC细胞,使其永生化,通过G418筛选,滤纸片法挑选单一克隆。对培养至第15代的永生化细胞进行染色体分析,免疫组化方法检测HLA-DR和hTERT蛋白的表达,反转录(RT)-PCR检测hTERT mRNA表达,以人黑素瘤A375细胞株为对照。结果:SV40T抗原介导的永生化黑素细胞具有正常的二倍体,HLA-DR和hTERT的表达未受影响,均为阴性,同时也未检测到hTERT mRNA的表达。结论:①转化的MC染色体为正常核型、HLA-DR的表达不受体外长期传代培养和SV40T抗原的影响;②SV40T抗原不通过上调端粒酶反转录酶活性途径介导细胞永生化,同时也说明该转化细胞不易向恶性转化。
- 常海邓军郝飞杨希川钟白玉叶庆佾
- 关键词：黑素细胞抗原人类白细胞抗原DR人端粒酶反转录酶
- SV40TAg基因和Cre/loxP系统诱导正常人黑素细胞可逆性永生化的初探被引量：3
- 2006年
- 目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分别在第6天和第10天用PCR、反转录(RT)-PCR和免疫组化方法检测SV40TAg基因在感染病毒上清的永生化黑素细胞内的表达,并采用左旋多巴(L-Dopa)染色、透射电镜、软琼脂克隆试验等检测细胞的生物学性状和功能。结果:Cre重组酶反转录病毒上清感染永生化黑素细胞经嘌呤霉素筛选和三苯氧胺诱导Cre重组酶表达,第6天时可检测到感染细胞中有SV40TAg基因的表达,第10天后则在细胞中检测不到SV40TAg基因表达;L-Dopa染色、透射电镜等鉴定结果表明,感染细胞具有与原代黑素细胞相同的生物学性状和功能。结论:联合应用Cre/loxP系统和SV40TAg基因可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞。
- 王鹰邓军郝飞杨希川钟白玉
- 关键词：CRE/LOXP系统SV40T抗原黑素细胞永生化可逆性
- SV40病毒T抗原真核载体的构建与表达被引量：2
- 2006年
- 目的设计、构建SV40病毒T抗原真核表达载体,并导入真核细胞进行表达鉴定。方法采用重叠延伸拼接法,从pUC19-SV40载体中亚克隆切除内含子的SV40病毒T抗原基因全长片段,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体上,酶切鉴定重组质粒;用脂质体转染的方法将构建的载体导入原代培养的正常人成纤维细胞进行表达,检测SV40病毒T抗原基因在成纤维细胞内的表达。结果SV40病毒T抗原基因成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中;转染成纤维细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出288 bp的特异性片段。结论本试验构建的SV40病毒T抗原重组质粒为利用SV40T抗原进行真核细胞研究提供了稳定、可靠的分子工具。
- 王鹰邓军杨希川郝飞
- 关键词：T抗原真核载体
- 白癜风胶囊对白癜风患者的临床效果研究被引量：3
- 2016年
- 目的:观察研究白癜风胶囊对比常规西药治疗白癜风疾病临床效果。方法:纳入2014年1月至2015年6月我科室收诊治疗的诊断为白癜风的患者80例,按随机数字表法分为观察组及对照组各40例,观察组给予白癜风胶囊治疗,对照组患者给予常规西药进行治疗,记录并分析治疗后两组患者相关指标的对比情况。结果:观察组治疗后全血粘度、红细胞沉降率、红细胞压积值分别为(5.36±1.02mP a/s、7.34±0.71nm/h、38.46±3.92%),均明显优于对照组(6.01±1.12mP a/s、6.52±0.91nm/h、45.53±3.63%);观察组治疗后血清IL-2、IL-6、IL-10的测定结果分别为(1.75±0.16mg/L、132.6±11.6ng/L、21.63±2.03ng/L),均明显优于对照组(2.79±0.14mg/L、171.4±10.9ng/L、26.43±2.63ng/L);观察组治疗前后血清细胞因子TNF-α和TGF-β的水平分别为(1.03±0.16ug/L、483.6±52.4pg/ml),均明显优于对照组(1.41±0.18ug/L、415.2±54.9pg/ml);(4)观察组治疗后临床总显效率达75.0%,明显高于对照组40.0%;(5)观察组治疗前后白癜风的病变面积为(99.6±18.5)cm2,明显优于对照组(131.4±22.5)cm2。结论:白癜风胶囊对白癜风疾病患者的临床效果优于单独应用常规西药,且无明显副作用,值得临床进一步研究和应用。
- 郭中华李伶吴金燕何泳洁邓军
- 关键词：白癜风胶囊白癜风
- SV40TAg和Cre／loxP系统诱导的正常人可逆性转化黑素细胞在豚鼠体内的存活能力和复色实验
- 2010年
- 目的研究sv40TAg基因和Cre／loxP系统在体外诱导正常人黑素细胞的可逆性转化以及转化细胞在豚鼠体内的存活能力和复色效果。方法用Cre—ERn病毒上清感染经SV40TAg基因转化的正常人黑素细胞（MCT），诱导Cre重组酶表达（MCTC）；过氧化氢法建立黄褐色雄性豚鼠白癜风动物模型，按黑素细胞移植方法进行原代黑素细胞和MCTC移植，观察MCTC在豚鼠体内的存活能力及复色效果。结果MCTC细胞移植实验结果显示，1个月左右移植区即可见色素沉着，连续观察3个月，可见0．5～1cm的黑色斑片或褐色斑片形成。移植成功率为82．5％，原代黑素细胞移植成功率为76．7％。病理观察移植12￡有明显黑素沉积，部分毛囊内也可见黑素沉积。结论联合应用SV40TAg基因和Cre／loxP系统可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞，具有与原代黑素细胞相似的在体存活率，具备在体黑素合成功能，可以达到良好的复色效果。
- 王鹰曾志华杨希川郝飞钟白玉
- 关键词：黑素细胞疾病模型白癜风CRE/LOXP系统
- SV40T基因转染黑素细胞遗传稳定性研究被引量：1
- 2008年
- 目的探讨SV40T抗原基因转染构建的永生化黑素细胞的遗传稳定性。方法体外培养黑素细胞,对第20代的永生化黑素细胞进行四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析细胞增殖情况,同时分析染色体核型,流式细胞仪分析细胞周期和DNA倍体;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析第20代细胞hMLH1、hMSH2错配修复基因表达,并提取细胞基因组,微卫星位点PCR产物进行变性聚丙烯酰胺电泳分析微卫星不稳定性。结果经过连续培养的第20代转染的黑素细胞左旋多巴染色阳性,增殖速度较原代培养黑素细胞明显增快,细胞周期S+G2期细胞比例较原代黑素细胞增多,同时未见异常DNA倍体,染色体仍为2倍体,转染细胞的hMLH1、hMSH2错配修复基因表达较正常黑素细胞上调;在1p22(D1S187)、5q14(D5S107)、18q12.2-12.3(D18S34)3个位点未出现微卫星不稳定性(m icrosatellite instab ili-ty,M I)。结论SV40T抗原基因转染的黑素细胞体外培养不出现遗传稳定性的异常改变。
- 常海邓军杨希川郝飞钟白玉叶庆佾
- 关键词：黑素细胞错配修复基因微卫星不稳定性
- SV40T抗原基因转染正常人黑素细胞的研究被引量：5
- 2006年
- 目的研究SV40 T抗原基因对体外培养的人正常黑素细胞的转化作用。方法用阳离子聚合物SofastTM介导基因转染,将含有SV40T抗原基因的真核表达载体SV40T-pEGFP导入原代培养的正常人黑素细胞进行稳定表达,G418筛选出阳性克隆,挑独立的单克隆扩大培养,检测SV40T抗原基因及SV40T蛋白在黑素细胞内的表达。结果分离获得转化细胞阳性克隆。提取DNA及RNA后用PCR法成功扩增出288 bp的片段,免疫组化及蛋白质印迹结果证实,转染黑素细胞核内有SV40T蛋白表达。结论 SV40T抗原基因可以成功诱导人黑素细胞的转化。
- 王鹰邓军杨希川郝飞钟白玉叶庆佾
- 关键词：黑素细胞猴病毒40
- 正常人黑素细胞体外培养及生物学鉴定被引量：8
- 2006年
- 目的体外分离、培养正常人表皮中的黑素细胞并对其进行生物学鉴定。方法在体外黑素细胞常规培养基中以TPA/bFGF/IBMX为基本添加剂,用胰蛋白酶消化法和G418从正常人表皮中纯化黑素细胞,用多巴(Dopa)染色、黑素含量测定、酪氨酸酶活性测定、免疫组化染色等方法对体外培养的黑素细胞的形态、结构和功能进行观察。结果多巴染色、黑素含量测定、酪氨酸酶活性测定及免疫组化染色结果均表明培养黑素细胞的生物学功能正常,保持正常的生物学特性。结论用TPA/bFGF/IBMX作为添加剂可在体外进行正常黑素细胞的纯培养,体外培养的黑素细胞的结构和功能保持正常的生物学特性。
- 王鹰邓军杨希川郝飞
- 关键词：黑素细胞细胞培养生物学功能
