福建省自然科学基金(2001F009)
- 作品数：7 被引量：43H指数：4
- 相关作者：饶平凡刘树滔陈菁陈躬瑞何火聪更多>>
- 相关机构：福州大学福建省肿瘤医院福建医科大学更多>>
- 发文基金：福建省自然科学基金教育部重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- TAT-PTD融合蛋白可能存在的跨膜递送作用机制被引量：15
- 2006年
- 为探讨TATPTD融合蛋白的跨膜递送作用机制,采用DNA重组技术构建pGEXTATGFP表达质粒.在E.coliBL21表达GST-TAT-GFP,并用谷胱甘肽(glutathione)Sepharose4B亲和柱进行纯化.GST-TAT-GFP在不同条件下与细胞的作用结果表明,GST-TAT-GFP能有效进入HeLa、SMMC7721、L02和BEL7402细胞,GST-TAT-GFP在递送时对时间和浓度有依赖关系.同时,温度对GST-TAT-GFP跨膜作用具有明显的影响,GST-TAT-GFP的跨膜作用受代谢抑制剂的影响很小,肝素的存在能明显抑制GST-TAT-GFP跨膜进入细胞的能力,GST-TAT-GFP对细胞活性没有影响.这些结果说明,TATPTD可能是通过与细胞表面的硫酸乙酰肝素等受体相结合介导融合蛋白跨膜递送进入细胞的.
- 何火聪刘树滔潘剑茹傅蓉陈菁陈躬瑞饶平凡
- 关键词：跨膜递送
- 变异型酪氨酸酶对治疗黑色素代谢异常疾病的研究被引量：1
- 2010年
- 本文在野生型酪氨酸酶(TYR)的基础上,运用分子生物学手段成功构建两种变异型表达质粒pET-Tat-TYR(含双精氨酸分泌信号肽变异型)、pGEX-TYR(缺失C端跨膜区的GST融合变异型),表达了两种变异型酪氨酸酶,并分别对产物进行了分析。该研究结果拓宽了蛋白药物在递送方面的应用范围,为酪氨酸酶在治疗色素代谢异常疾病方面开辟了新的视野,并为酪氨酸酶的有效应用提供理论指导。
- 陈菁刘树滔郑淑霞邓文汉饶平凡
- GST-TAT-GFP融合蛋白的表达、纯化及鉴定被引量：5
- 2006年
- 目的获得融合TAT短肽的融合蛋白GST-TAT-GFP,以用于阐明TAT短肽的跨膜递送机理。方法以质粒pGEX-GFP为模板,扩增目的基因TAT-GFP,将其克隆至质粒pGEX-2T,用所构建的质粒pGEX-TAT-GFP转化大肠杆菌BL21并诱导表达,利用GS-4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western blot及细胞跨膜实验鉴定。结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约54.3 kD的蛋白,其相对分子质量与GST-TAT-GFP融合蛋白相符;Western blot显示该融合蛋白能够被抗GFP的抗体特异性识别;细胞实验表明融合TAT短肽的融合蛋白能跨膜进入细胞L-02、SMMC-7721、Hela和BEL-7402。结论在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GST-TAT-GFP融合蛋白。
- 何火聪刘树滔潘剑茹陈躬瑞饶平凡
- 关键词：基因表达
- 小鼠酪氨酸酶的克隆及在大肠杆菌中的表达被引量：1
- 2005年
- 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT -PCR)方法,从小鼠黑色素瘤总RNA中扩增得到小鼠酪氨酸酶的cDNA .该基因重组到T7启动子控制下的表达载体pET - 2 2b(+)中,构建表达质粒pET -TYR并转化大肠杆菌Rosetta (DE3) .SDS -PAGE及蛋白质序列测定表明,经0 .8mmol/L异丙基硫代- β-D -半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组的小鼠酪氨酸酶,表达量约占菌体总蛋白质的2 5 % 。
- 邓文汉卢菀华傅蓉陈菁饶平凡刘树滔
- 关键词：基因克隆基因表达大肠杆菌
- Tat蛋白转导区域位于融合蛋白C端时的跨膜递送作用被引量：8
- 2005年
- 对Tat蛋白转导区域(PTDTat)的C端融合蛋白的跨膜递送作用进行探讨.采用DNA重组技术将PTDTat融合在绿色荧光蛋白(GFP)的羧基(C)端,构建重组表达质粒pGEXGFPTat,IPTG诱导其表达后,采用谷胱甘肽Sepharose4B(GS4B)亲和层析,获得纯化的谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的重组蛋白GSTGFPTat.该蛋白与HeLa细胞共培养,荧光显微镜观察其荧光强度随着蛋白浓度的增高而增强.流式细胞仪分析发现,在4.0μmolL蛋白浓度下,转导效率高达80.0%;而在GFP氨基(N)端含有PTDTat的融合蛋白GSTTatGFP的阳性对照组,转导效率只有32.9%.实验结果表明,C端融合的PTDTat同样具有对外源蛋白的跨膜递送作用.该结果可能为PTDTat在蛋白药物递送方面的有效应用提供理论依据.
- 陈菁傅蓉刘树滔何火聪饶平凡
- 关键词：跨膜递送
- hCuZn-SOD基因的克隆、表达及其产物的初步纯化和表征被引量：16
- 2004年
- 为获得hCuZn-SOD基因,根据GenBank中人铜锌超氧化物歧化酶(hCuZn-SOD)基因碱基序列,设计扩增引物,用RT-PCR方法从人的肝细胞中克隆出hCuZn-SODcDNA序列,并将它插入pUCm-T载体中,经过DNA序列测定证实,该片段序列的一个碱基发生突变(与报道基因相比),引起其编码第116个氨基酸由G变为D.采用定向克隆的方法将hCu Zn-SOD的cDNA片段克隆到表达载体pGEX-2T上,构建表达质粒pGEX-SOD,并转化大肠杆菌BL21(DE3).SDS-PAGE分析证实,经IPTG诱导,融合蛋白GST-SOD获得高效表达.破碎菌体、上清经谷胱甘肽亲和层析初步纯化后,得到纯度达90%的目的蛋白.活性实验表明,GST-SOD具有生物活性.
- 陈春陈躬瑞刘树滔卢菀华饶平凡
- 关键词：克隆RT-PCR融合蛋白
- PTD-Tat之C端融合在活体体内的跨膜递送作用被引量：4
- 2006年
- 报道了Tat蛋白转导区域(PTD-Tat)的C端融合蛋白在线虫和小鼠体内的跨膜递送作用.将重组表达质粒pGEX-GFP-Tat在大肠杆菌中高效表达出的融合蛋白GST-GFP-Tat对小鼠腹腔注射(ip)17h后,荧光显微镜观察其心、肝和肾组织,均检测到强烈的绿色荧光,甚至该蛋白跨越了血脑屏障(BBB).此外用融合蛋白喂食线虫发现蛋白分布于线虫消化管道及其原体腔,且表现出的跨膜递送活性与喂食时间和蛋白浓度呈现正相关.该研究结果拓宽了PTD-Tat在蛋白药物递送方面的应用范围,为蛋白质疗法开辟了新的视野,并为其有效应用提供理论指导.
- 陈菁刘树滔饶平凡邱小文杨映红
- 关键词：腹腔注射线虫跨膜递送
