国家自然科学基金(30471547)
- 作品数：17 被引量：21H指数：3
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- 不同途径接种乙脑病毒prME蛋白编码基因DNA疫苗所致BALB/c鼠的细胞免疫被引量：4
- 2007年
- 目的:研究经不同途径接种乙脑病毒prME蛋白编码基因DNA疫苗所诱导的细胞免疫。方法:将乙脑病毒prME蛋白编码基因DNA疫苗(命名为pJME)分别以肌注、滴鼻两种免疫方式免疫BALB/c鼠,流式细胞仪检测脾脏CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群,乳酸脱氢酶释放实验测定脾脏特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。结果:pJME肌注组与滴鼻组免疫鼠CD4+T淋巴细胞百分比(30.91+0.72)%、(27.89+0.42)%,均高于灭活疫苗与载体肌注组(23.73+0.17)%、(23.78+0.21)%(P<0.05),肌注组显著高于滴鼻组(P<0.05);而CD8+T淋巴细胞百分比(14.62+0.25)%、(13.73+0.50)%,也均高于灭活疫苗和载体肌注组(10.80+0.39)%、(11.97+0.06)%(P<0.05),肌注组与滴鼻组无显著差异(P>0.05);两组有明显CTL效应(pJME肌注组29.1%,pJME滴鼻组17.1%),明显高于载体肌注组6.0%,pJME肌注组明显优于滴鼻组。结论:pJME以两种途径免疫鼠时可诱导明显细胞免疫反应。
- 周言张琳翟永贞李喜梅王占英冯国和
- 关键词：T淋巴细胞亚群
- 流行性乙型脑炎病毒结构蛋白编码基因的重组构建被引量：1
- 2005年
- 目的:建立流行性乙型脑炎病毒(JEV)C、prME,E等结构蛋白编码基因克隆。方法:病毒感染C6/36细胞,RT-PCR法依次获取该病毒结构蛋白基因并进行DNA测序分析,PCR克隆法将PCR产物分别构建于真核表达载体pcDNA 3.1的BamH I与EcoR I酶切位点并依次命名为pJC、pJME与pJE,通过DNA测序、电泳以及限制性内切酶分析加以鉴定。结果:JEV C、prME与E基因片段分别为380、2 001以及1 500 bp,各基因测序结果与发表的JEV JaGAr-01株相对应序列相一致,从重组质粒释出的插入子分别与各基因大小相符合。结论:pJC、pJME与pJE重组质粒分别含有C、prME与E蛋白编码基因。
- 冯国和王玉梅刘宁刘沛王占英竹上勉
- 关键词：流行性乙型脑炎病毒重组质粒DNA测序
- 流行性乙型脑炎病毒NS4A蛋白基因的克隆及其在大肠埃希菌的表达
- 2005年
- 目的:克隆及表达流行性乙型脑炎病毒(JEV)NS4A蛋白基因。方法:JEV JaGAr-01株感染C6/36细胞,RT-PCR法获取JEV NS4A蛋白基因并采用AB I PRSMTM310 Genetic Analyzer进行DNA测序分析,PCR克隆方法将RT-PCR产物构建于原核表达载体PET-3 a的BamH I与EcoR I酶切位点并命名为pNS4A,电泳进行限制性内切酶分析。结果:JEV NS4A蛋白基因大小为446 bp,DNA测序与发表的JEV JaGAr-01株相对应的DNA序列相符合,酶切后从重组质粒释出的插入子与JEV NS4A蛋白基因大小相一致。pNS4A在原核细胞内表达的特异蛋白分子量约16 kDa,与JEV NS4A蛋白理论计算相一致。结论:获取的JEV NS4A蛋白基因来自于JaGAr-01野生株,pNS4A在大肠埃希菌中表达的蛋白产物为JEV NS4A蛋白。
- 冯国和王玉梅刘宁王占英刘沛竹上勉
- 关键词：流行性乙型脑炎病毒DNA测序蛋白表达
- 乙型脑炎病毒C蛋白编码基因重组质粒构建与表达被引量：1
- 2013年
- 目的构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)C蛋白编码基因重组子并鉴定。方法以JEV SA14-14-2株总RNA为模板,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增JEV C蛋白编码基因,克隆至pMD19-TSimple载体测序。为便于分析JEV C蛋白编码基因重组子在哺乳动物细胞中的表达,在JEV C蛋白编码基因5′端附加FLAG序列,并亚克隆至pcDNA 3.1(+)载体中,构建重组子pJc并经酶切及DNA测序分析。脂质体法将pJc转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。免疫荧光检测转染的CHO细胞中JEV C蛋白分布与表达。结果 pJC经BamH I/EcoR I酶切释出的插入子片段(414bp)分别与预期结果相符合。所编码的融合蛋白主要分布于胞质,少量分布于胞膜。结论 pJC成功构建,转染的CHO细胞可表达JEV C蛋白。
- 翟永贞王志峰冯国和
- 关键词：病毒蛋白质类蛋白质CCHO细胞
- ICAM-1基因修饰的日本脑炎DNA疫苗诱导BALB／c鼠脾脏树突状细胞功能的研究
- 2011年
- 细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）在基因疫苗方面已有研究报道，有学者研究表明ICAM-1能提供给T细胞共刺激信号，并且证实该刺激信号通路独立于CD86介导的T细胞活化的第二信号通路。
- 翟永贞周立夫马力冯国和
- 关键词：ICAM-1BALB/C鼠DNA疫苗诱导细胞功能日本脑炎基因修饰树突状
- 流行性乙型脑炎生物疫苗的研究进展被引量：4
- 2006年
- 流行性乙型脑炎(JE)是一种经蚊虫传播、人畜共患、严重危害中枢神经系统的急性传染病,我国将其归为法定乙类病毒性传染病。由于该病重症病死率高,且易造成不同程度的神经系统后遗症,所以一直是严重影响世界公共卫生问题的主要疾病之一,预防疫苗也成为许多国家的研究热点内容。鉴于目前大部分国家和地区应用的各类疫苗存在制备费用高、易致变态反应以及出现神经系统症状等缺点,一个寻求稳定、安全以及新型的JE生物疫苗研制战略正在兴起,包括灭活疫苗与减毒活疫苗尚需完善,亚单位疫苗继续开发以及DNA疫苗进一步深入研究等。该文就近年来JE生物疫苗的研究现状作一综述。
- 周言冯国和
- DNA疫苗靶向增强效应的研究进展被引量：1
- 2008年
- DNA疫苗的优势在于通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，激发机体产生特异性的体液与细胞免疫应答反应。此类疫苗接种后类似自然感染过程，易于制备和纯化，无活疫苗毒力回升等问题，因而成为具有应用前景的疫苗之一。目前DNA疫苗所致的体液与细胞免疫效应仍不如传统疫苗，进一步增强DNA疫苗免疫效应成为该领域的研究热点。虽然免疫机制仍不十分清楚，但树突状细胞在诱导免疫反应中的重要作用已经得到肯定。该文从树突状细胞及其表面分子在DNA疫苗诱导细胞毒性T细胞反应中的作用，以及靶向树突状细胞增强免疫效应三个层面的研究进展作一综述。
- 周言冯国和
- 关键词：树突细胞
- ICAM-1编码基因对乙型脑炎DNA疫苗树突状细胞功能的影响
- 2013年
- 目的:研究细胞间粘附分子1(ICAM-1)编码基因对日本脑炎(JE)DNA疫苗脾脏树突状细胞功能的影响。方法:套式RT-PCR法获取BALB/c鼠ICAM-1编码基因,构建重组子pJME/ICAM-1和pICAM-1,脂质体法转染上述质粒于CHO细胞,Western blot法检测转染的CHO细胞中目的蛋白表达。实验分5组,包括:pJME/ICAM-1、pJME+PICAM-1、pJME、JE灭活疫苗和pcDNA3.1(+)免疫组,以不同免疫原肌注免疫BALB/c小鼠,流式细胞仪检测经不同免疫原免疫鼠后脾脏DC表型、抗原吞噬功能以及混合淋巴细胞反应。结果:融合表达重组质粒pJME/ICAM-1和单质粒pICAM-1经鉴定构建正确。pJME/ICAM-1组CD11c+CD86+DC和CD11c+ICAM-1+DC比例分别为(6.92±1.40)%、(7.18±0.57)%,高于其它免疫组(均P<0.05);pJME/ICAM-1和pJME+pICAM-1组DC表面CD80和MHCⅡ表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05);pJME/ICAM-1与pJME+pICAM-1组内吞能力明显增强,平均荧光强度分别为437.11±47.60、416.67±29.12,显著高于其它组(P<0.05)。比较不同免疫原对细胞分裂的作用,以pJME/ICAM-1组最强,(73.69±7.32)%CD4+T细胞发生分裂,(45.40±2.57)%CD8+T细胞发生分裂,显著高于对照组(P<0.05)。结论:ICAM-1编码基因能够促进JE DNA疫苗脾脏树突状细胞的成熟,能够提供独立或放大B7分子的协同刺激信号。
- 翟永贞马力冯国和
- 关键词：DNA疫苗细胞间粘附分子1树突状细胞共刺激分子
- 乙脑病毒prME蛋白与BALB／c鼠IgG Fc段编码基因联合构建DNA免疫研究被引量：2
- 2008年
- 目的研究IgG Fc编码基因对流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）DNA疫苗免疫增强效应的影响。方法巢式RT-PCR法从BALB／c鼠脾组织获取IgG Fc段编码基因，用限制性内切酶从含流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）prME蛋白基因重组子获取prME蛋白基因，分别插入同一真核表达载体pcDNA3．1（＋）不同酶切位点，构建重组子pJME／IgG Fc并经酶切及DNA测序分析。脂质体法将pJME／IgG Fc转染CHO细胞。免疫荧光、Western blot法检测转染的CHO细胞中融合蛋白分布与表达。将pJME／IgG Fc肌注免疫BALB／c鼠，检测小鼠脾特异性细胞毒T细胞（CTL）杀伤活性和中和抗体滴度。结果pJME／IgGFc经BamHI／EcoRI和BamHI／NotI酶切释出的插入子大小（2001 bp、2730 bp）分别与预期结果相符合。所编码的融合蛋白相对分子质量（Mr）为101×10^3，主要分布于胞浆，少量分布于胞膜，pJME／IgG Fc转染CHO细胞经32次传代仍可表达融合蛋白。pJME／IgG Fc免疫组中和抗体滴度与CTL活性较pJME及灭活疫苗组均升高（P〈0．05）。结论pJME／IgG Fc成功构建，转染的CHO细胞可稳定表达融合蛋白，IgG Fc段编码基因能够增强JEV DNA疫苗的细胞和体液免疫应答。
- 李喜梅周言翟永贞马力冯国和
- 关键词：乙型脑炎病毒FC段CHO细胞
- 乙型脑炎病毒prME、E蛋白基因表达与DNA免疫效率对比研究被引量：4
- 2005年
- 目的研究乙型脑炎病毒prME、E蛋白表达特点,比较不同接种途径所致DNA免疫效率。方法脂质体法将质粒(pJME、pJE)转染于HepG2、COS-1及KN73细胞;免疫印迹法分析质粒表达及与转染剂量关系,鉴定DNA免疫鼠血清抗体性质;肌内(100μg/次)与基因枪(3μg/次)注射法将质粒免疫BALB/c鼠,腹腔注射乙型脑炎病毒(105PFU/100μl)进行病毒攻击。80%空斑减少中和试验法检测中和抗体滴度。结果pJME转染的细胞内可检测到相对分子质量约为72×103与11×103两种蛋白,pJE转染的细胞内检测到相对分子质量约为54×103蛋白。蛋白表达程度由高至低顺序为10μg/孔>5μg/孔>3μg/孔。pJME与JE灭活疫苗免疫的BALB/c鼠在病毒攻击后21 d全部存活,pJE免疫鼠部分存活。pJME所致中和抗体滴度高于pJE。肌内注射组所致的最终中和抗体滴度等同于基因枪注射组。pJME免疫鼠产生血清抗体仅与JEV E蛋白发生反应。结论pJME与pJE在不同转染细胞内表达效率不同;转染剂量和蛋白表达呈一定剂量依赖性;pJME免疫效果优于pJE,基因枪注射所致免疫效率高于肌内注射;DNA免疫所致的中和抗体效价水平与保护性免疫效果呈一致性;DNA免疫鼠血清中和抗体含针对JEV E蛋白的抗JEV-E抗体。
- 冯国和王玉梅刘沛王占英乔光彦
- 关键词：病毒蛋白质类基因表达免疫印迹法
