国家自然科学基金(81171946)
- 作品数：27 被引量：47H指数：4
- 相关作者：孙强明陈俊英潘玥赵玉娇王晓丹更多>>
- 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院昆明医科大学北京协和医学院更多>>
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- 登革病毒四型联合重组包膜蛋白Ⅲ区的表达和免疫原性鉴定被引量：1
- 2016年
- 登革热在全球范围内广泛流行,但是目前为止却仍然没有疫苗上市,疫苗的开发迫在眉睫。抗体依赖增强感染效应是登革病毒疫苗开发中遇到的一个瓶颈问题。研究表明登革病毒的包膜蛋白Ⅲ区能够介导中和抗体产生,且诱导产生较少的交叉抗体或无交叉抗体,能够大大减弱抗体依赖增强感染效应,因而是登革热重组蛋白疫苗的首选靶标。通过酵母密码子优化后合成同时包含4种血清型登革病毒包膜蛋白Ⅲ区的四价联合DV EDⅢ蛋白序列,随后构建酵母表达质粒,并获得酵母表达菌株,经诱导后四联DV EDⅢ蛋白获得高效表达。通过Western blot、ELISA检测及蛋白质免疫原性鉴定,结果表明登革病毒四联DV EDⅢ蛋白表达质粒构建成功,重组蛋白在毕赤酵母获得高效表达,免疫小鼠后能够介导产生较高水平的血清效价。这表明已获得了能引起有效免疫反应的四型登革病毒EDⅢ蛋白,为登革病毒疫苗的研究提供了良好的基础。
- 邱丽娟赵玉娇李多黄新伟王晓丹席珏敏潘玥陈俊英孙强明
- 关键词：登革病毒疫苗重组蛋白
- 2017年云南省登革病毒Ⅰ型分离株NS1基因的鉴定及分析
- 2018年
- 目的鉴定并分析2017年云南省登革病毒Ⅰ型(dengue virusⅠ,DENVⅠ)分离株的NS1基因。方法采用病毒RNA提取试剂盒提取登革热(dengue fever,DF)患者血清RNA,RT-PCR法鉴定病毒类型,并扩增DENVⅠ的NS1基因,进行测序。应用BIOEDIT软件比对NS1及DENVⅠ标准株(DQ672562.1)的核苷酸及氨基酸序列,并进行突变分析。应用MEGA 5.1软件中的NJ法(1000 Boot strap replicate)构建NS1基因的系统进化树。结果共分离获得16株DENVⅠ的NS1基因,经比对发现,201703、201704、201708、201709、201713分离株NS1基因第21位碱基由C变为T(无义突变);201705、201706、201712分离株NS1基因第289位碱基由T变为A(有义突变),氨基酸曲L变为M。16株分离株NS1基因其他突变位点均相同,共85处发生碱基突变,其中5个为有义突变。16株分离株与2011-China Donggua(JQ048541.1)、2008-Singapore(GU370049.2)、2014-Taiwan(KU365900.1)、2005-China Fujian(DQ193572.1)、2016-Malaysia(KX452065.1)、2007-Indonesia(KC762646.1)、2015-South Korea(KP406802.1)、2006-Japan(AB178040.1)、2007-Thailand(HM469966.1)、2013-singapore(KJ806945.2)有较近的亲缘关系。结论 2017年云南省16株分离毒株均为DENVⅠ,可能属于东南亚国家的输入性毒株。
- 文送娇林垚席珏敏王晓丹陈俊英潘玥叶超管娇琼洪姗孙强明
- 关键词：登革病毒NS1基因基因突变系统进化分析
- 慢病毒介导的HIF-1α mODD在肿瘤细胞中的高表达
- 2011年
- 目的在肿瘤细胞中利用重组慢病毒介导缺氧诱导因子-1α突变体(HIF-1α mODD)在正常氧压下高表达,以模拟肿瘤缺氧微环境下肿瘤细胞中HIF-1α的高表达,为研究HIF-1介导的缺氧信号通路及其在肿瘤细胞中的作用提供实验模型。方法将含HIF-1αmODD基因片段的慢病毒表达质粒pWPI GW/HIF-1α mODD,与pVSVG及pSPAX质粒共转染人胚肾293T细胞,包装制备重组慢病毒,重组病毒经过纯化后直接感染GLC、H157和YTMLC等肿瘤细胞,并在正常氧压条件下培养,通过RT-PCR、免疫印迹等方法检测HIF-1α mODD在细胞中的表达水平。结果重组慢病毒介导HIF-1α mODD在GLC、H157和YTMLC细胞内获得高表达。结论成功模拟了肿瘤细胞在缺氧微环境下高表达HIF-1α的情况,为体外研究HIF-1α在肿瘤血管新生及肿瘤生长中的作用提供途径。
- 赵玉娇龙海亭潘玥李华陈俊英施海晶马绍辉孙强明
- 关键词：HIF-1Α慢病毒缺氧微环境
- 埃博拉病毒包膜糖蛋白二级结构及B细胞表位的预测
- 2015年
- 目的预测并分析从2014年西非埃博拉出血热暴发地区感染患者分离的扎伊尔型病毒株包膜糖蛋白（glycoprotein,GP）的二级结构及B细胞表位。方法通过Gen Bank搜索近期公布的分离自西非地区的扎伊尔型埃博拉病毒株基因组,获得GP1、GP2和s GP 3种包膜糖蛋白的基因及氨基酸序列,采用互联网服务器在线预测其二级结构及B细胞表位,并分析蛋白的各种氨基酸组成比例及可能的蛋白结合位点,通过亲/疏水性等参数判断氨基酸序列中可能暴露在蛋白结构表面或隐藏在内部的区段。结果在编码GP1、GP2和s GP的氨基酸中,占组成比例最多的均为苏氨酸。GP1和s GP可能的蛋白结合位点较多,且整个蛋白暴露于表面的区域和隐藏区域呈均匀相间分布;GP2结构较前二者特殊,存在一个暴露在蛋白结构表面的大片段的无序结构区域。GP1 N-末端第20～37和166～186区段,GP2 N-末端第361～379区段,s GP N-末端第20～37和166～185区段,可能为跨膜螺旋结构。s GP可能存在4个含有二硫键的区域。B细胞表位分析结果显示,GP1和GP2中疏水区域主要集中在N-末端第1～325位氨基酸之间;亲水区域主要集中在N-末端第326～676位氨基酸之间;亲水与疏水区域分界明显,几乎无交叉;可能存在2个线性表位,分别位于N-末端第324～450、461～676区段;预测共存在25个可能形成构象表位的氨基酸位点或序列,其中可能性在90%以上的位点或序列有6个。结论通过对此次流行于西非的埃博拉病毒包膜糖蛋白的二级结构及可能性B细胞表位的预测,为实验确定埃博拉病毒包膜糖蛋白的结构与功能、B细胞表位免疫识别以及埃博拉病毒预防、治疗和诊断制品的研发提供了参考。
- 赵玉娇黄新伟李多邱丽娟孙强明
- 关键词：埃博拉病毒糖蛋白蛋白质二级结构B细胞表位
- Ⅱ型登革病毒前膜抗体对该病毒在THP-1细胞中复制能力的影响
- 2018年
- 目的探讨Ⅱ型登革病毒(dengue virusⅡ,DENVⅡ)前膜(presynaptic membrane,prM)抗体对DENVⅡ在THP-1细胞中复制能力的影响。方法采用不同稀释度(1/4~1/16 384)的DENVⅡanti-pr M单克隆抗体分别与不同MOI的DENVⅡ(MOI分别为3、0.75及0.19)复合感染THP-1细胞。建立DENVⅡ荧光定量PCR检测标准曲线,检测THP-1细胞培养上清液的病毒拷贝数。结果 DENVⅡ按MOI=3感染THP-1细胞,当prM稀释度为1/16和1/16 384时诱发THP-1细胞产生病毒的载量较高,prM稀释度为1/64和1/256时抑制病毒生长;DENVⅡ按MOI=0.75感染THP-1细胞,当prM稀释度1/16时可诱发更高浓度病毒载量;DENVⅡ按MOI=0.19感染THP-1细胞时,不会诱导产生高浓度的病毒载量。结论中浓度pr M抗体可抑制DENVⅡ在THP-1细胞中的复制能力,而高及低浓度prM抗体可促进DENVⅡ在THP-1细胞中的复制能力。
- 姜黎明杨佳佳罗佳叶超文送娇孙强明
- 关键词：前膜抗体THP-1细胞
- 粪便标本中诺如病毒GⅡ拷贝数定量检测方法的建立和应用被引量：1
- 2020年
- 目的构建诺如病毒GⅡ(Norovirus GenogroupⅡ,NoV GⅡ)拷贝数标准质粒及其检测体系。方法将合成高度保守的NoV GⅡ基因序列片段克隆至pUC57载体上,构建NoV GⅡ标准质粒,采用聚合酶链反应(PCR)进行验证。通过实时荧光定量PCR扩增曲线结果绘制C t值与病毒拷贝数的标准曲线,求得其相应的标准曲线方程。采用建立的标准质粒及其检测体系对2018年12月昆明市儿童医院4份临床粪便标本进行检测。结果经PCR验证,NoV GⅡ拷贝数的标准质粒构建正确。采用实时荧光定量PCR的扩增曲线获得C t值与病毒拷贝数相对应的标准曲线方程为Y=-3.972X+39.03,R^2=0.991,4份粪便标本原液NoV GⅡ病毒拷贝数分别为30443.45、9468.40、53176.69、4493.12 copies/μL。结论成功建立用于检测粪便标本中NoV GⅡ病毒拷贝数的标准质粒及其检测体系,可为疾病的预防控制和相关试验研究提供有效的定量检测方法。
- 赵跃丽饶清孙强明张兰胜
- 关键词：实时荧光定量PCR
- Ⅲ型登革病毒在C6/36及Vero细胞中复制对其毒力的影响
- 2019年
- 目的探讨Ⅲ型登革病毒(dengue virus,DENV)在C6/36和Vero细胞中复制对其毒力的影响。方法将DV3-1及DV3-2两株Ⅲ型DENV在C6/36细胞上接种传代培养,待其毒力稳定再接种至Vero细胞连续传代培养。用Ⅲ型DENV标准质粒检测不同代次病毒拷贝数,PCR扩增获得传代毒种全长基因序列,并与原代病毒基因序列进行比对。结果DV3-1在C6/36细胞上传代至第17代次(P17-C6/36)时毒力保持稳定,DV3-2在盲传过程中均未见明显的细胞病变;将DV3-1和DV3-2第17代次病毒在Vero细胞上继续传代,DV3-1传至第10代次(P10-Vero)CPE为40%,DV3-2传至第4代次CPE达30%。DV3-1在P17-C6/36时具有较高的病毒拷贝数,在P0(原代病毒)及P10-Vero时病毒拷贝数偏低。与P0比较,P17-C6/36及P10-Vero全长碱基共16处发生突变,导致12个氨基酸的非同义突变,其中P0和P10-Vero在第5826、6251、7907位点碱基相同,P17-C6/36相应的氨基酸位点(第1942、2084、2636位点)均发生非同义突变。结论传代细胞更换可对Ⅲ型DENV的毒力造成影响,多次传代及更换细胞传代后仍可能发生回复突变。本研究为后续DENV减毒策略的研究提供了实验依据。
- 林垚洪珊王晓丹陈俊英潘玥孙强明
- 关键词：C6/36细胞VERO细胞毒力
- CpG ODN佐剂序列IMB-AC5的体外免疫刺激活性分析被引量：1
- 2017年
- 目的对CpG ODN候选佐剂IMB-AC5进行体外免疫刺激活性分析。方法以目前国外进入临床研究的两种CpG ODN佐剂序列(Coley 7909和Dynavax ISS1018)为对照,采用~3H-TDR法检测IMB-AC5刺激人外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBLs)的增殖活性;流式细胞术分析CD19+B活化细胞表面CD69表达水平;ELISA法检测刺激后GEN细胞产生的IL-6和IFNα水平。结果 3种CpG ODN佐剂均能明显刺激人PBLs的增生,IMB-AC5刺激增生能力优于Dynavax ISS1018,略低于Coley 7909;IMB-AC5活化CD19+B细胞表面CD69表达水平与Coley7909相似,Dynavax ISS1018活化效果略低于前二者;3种CpG ODN佐剂体外活化树突状细胞水平差异较大,且呈明显的剂量依赖,IMB-AC5的最佳活化浓度范围为0.15~1.5μmol/L,Coley 7909的最佳活化浓度范围为<0.25μmol/L,活化效果均优于Dynavax ISS1018。结论 IMB-AC5可作为有效的疫苗候选佐剂,且不低于国外同类佐剂的体外免疫刺激活性。
- 赵玉娇蔡路奎王晓丹席珏敏陈俊英潘玥邱丽娟姜黎明孙强明
- 关键词：CPGODN佐剂
- CpG ODN佐剂序列IMB-AC5联合乙型肝炎疫苗的免疫原性分析
- 2016年
- 目的评价Cp G ODN佐剂序列IMB-AC5联合乙型肝炎疫苗的免疫原性,以评估IMB-AC5佐剂的应用前景。方法利用市售的单铝佐剂乙型肝炎疫苗,根据相同配比加入3种Cp G ODN（IMB-AC5及Coley 7909和Dynavax 1018）,作为实验组（V-AC5、V-7909和V-1018）,并以乙型肝炎疫苗为对照组,分别免疫BALB/c小鼠,于免疫后2、4、6、8周,经尾静脉采血,第10周处死小鼠采集全血,分离血清,采用乙肝表面抗体试剂盒检测anti-HBs抗体水平,ELISA法检测Ig G1/2a亚型抗体比例;ELISPOT法检测小鼠脾细胞IFNγ表达水平。结果免疫后0~4周内,各组小鼠血清抗体水平均无明显变化,第6周开始呈明显上升趋势,至第8周后趋于平缓;各实验组抗体水平均明显高于对照组（P〈0.05）,V-AC5显示出与V-7909同样良好的体液免疫效果,略优于V-1018。免疫后各实验组小鼠血清中Ig G2a/Ig G1比例明显高于对照组。各实验组小鼠脾细胞斑点数明显高于对照组（P〈0.05）;V-AC5斑点数介于其他两个实验组之间。结论 IMB-AC5佐剂能显著活化B细胞产生抗体并具有刺激细胞免疫的效果,可增强疫苗的免疫原性。
- 赵玉娇蔡路奎王晓丹席珏敏陈俊英潘玥邱丽娟姜黎明孙强明
- 关键词：CPGODN佐剂乙型肝炎疫苗免疫原性
- Ⅲ型登革病毒在THP-1细胞上的ADE模型建立
- 2017年
- 登革热(dengue fever,DF)是由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型登革病毒(dengue virus,DENV)引起的急性传染病,抗体依赖增强感染(antibody-dependent enhancement,ADE)是自限性的登革热以及危及生命的登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)或登革休克综合症(dengue shock syndrome,DSS)等重症的主要原因。采用不同稀释度的Ⅱ型登革病毒prM前膜抗体与分离自云南西双版纳重症病人的Ⅲ型登革病毒复合感染THP-1细胞,通过实时荧光定量PCR发现亚中和浓度prM前膜抗体诱发THP-1细胞液中更高浓度的病毒载量。在THP-1细胞系上的研究可为后续研究登革病毒ADE打下坚实的基础。
- 姜黎明杨佳佳罗佳叶超文送娇孙强明
- 关键词：THP-1细胞
