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国家现代农业产业技术体系建设项目(CARS-46-11): 作品数：10 被引量：91H指数：6; 相关作者：曾令兵周勇徐进张辉范玉顶更多>>; 相关机构：中国水产科学研究院长江水产研究所华中农业大学上海海洋大学更多>>; 发文基金：国家现代农业产业技术体系建设项目中国水产科学研究院基本科研业务费专项基金国家重点基础研究发展计划更多>>; 相关领域：农业科学生物学更多>>

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立被引量：15: 2013年; 根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高,且不需昂贵仪器设备,为快速检测草鱼呼肠孤病毒与诊断草鱼出血病提供了简捷快速的技术手段。; 张金凤曾令兵张辉周勇肖艺苏岚高正勇; 关键词：草鱼出血病呼肠孤病毒

鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR检测方法的建立及应用被引量：17: 2013年; 针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒。经PCR鉴定与测序分析确认正确后,以10倍梯度稀释重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了鲤疱疹病毒Ⅱ型的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R2)达到0.999 1,斜率为-3.412;对初始模板定量检测的范围为1×101～1×107copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出鲤疱疹病毒Ⅱ型,而对大鲵虹彩病毒(GSIV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)以及空白对照无检测信号。取江苏射阳和宝应两地疑似患病鲫组织核酸作为模板进行荧光定量PCR,结果表明反应体系中的病毒量分别为6.89×104copies/μL和3.02×102copies/μL。本研究建立的鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强,对因鲤疱疹病毒Ⅱ感染引起的养殖鲫造血器官坏死症的诊断与病毒病原定量检测有重要意义。; 周勇曾令兵张辉范玉顶徐进; 关键词：TAQMAN REAL-TIME PCR

鲤疱疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR检测方法的建立及应用: 针对鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)DNA解旋酶基因编码区序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增出长度为1 446 bp的基因编码区片段,克隆到pMD19T载体上,构建重组质粒...; 周勇曾令兵张辉范玉顶徐进; 关键词：鲫鱼; 文献传递

鲤疱疹病毒2型武汉株的分离与鉴定被引量：31: 2013年; 采用细胞培养、超薄切片电镜观察、巢式PCR检测以及病毒DNA克隆与测序分析等技术。从湖北武汉一循环水养殖系统中患出血病异育银鲫（Carassius auratusgibelio）体内分离鉴定了一株鲤疱疹病毒2型（Cyprinid herpesvirus2，CyHV-2）病毒，命名为鲤疱疹病毒2型武汉株（CyHV-2．WH）。患病鱼组织匀浆液接种锦鲤鳍条细胞系（Koi．Fin）可产生典型的细胞病变效应。用患病鱼组织匀浆液与细胞培养物分别人工感染异育银鲫，均可重复出与自然发病相同的症状，死亡率达100％。患病鱼脾与肾脏组织超薄切片电镜观察结果显示，病毒为具囊膜的球形病毒，囊膜直径为170-200am，病毒衣壳直径为110～120nm，病毒在细胞核内复制、组装。采用CyHV-2的特异引物对病鱼样本和感染细胞培养物样本进行巢式PCR检测，均能扩增出357bp的目的条带，将该扩增产物进行测序与比对分析后发现，其与GenBank中已报道的CyHV-2毒株的DNA解旋酶基因高度同源（99．44％以上）。与鲤疱疹病毒3型（CyHV-3）也有较高的同源性（81．55％）。系统进化分析结果显示，CyHV-2．WH株与JS2012、H．Fukuda、YCll0907等CyHV-2病毒株属同一分支。; 徐进曾令兵杨德国张辉马杰江南范玉顶; 关键词：异育银鲫病毒分离病毒鉴定

锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增检测方法的建立被引量：4: 2015年; 为建立一种操作简单、结果准确可靠、结果判定直观、成本低廉的现场快速检测方法,为锦鲤疱疹病毒（Koi herpes virus,KHV）疾病的防控提供技术支撑,根据KHV保守的DNA聚合酶（DNA polymerase,Sph）基因,设计一组单交叉扩增引物,以构建的Sph基因重组质粒作为标准DNA模板,采用单交叉引物等温扩增技术（single cross priming amplification,SCPA）进行扩增,优化反应体系的引物浓度组合、Mg2＋浓度、d NTPs浓度、反应温度和时间,并结合核酸试纸条技术（nucleic acid test strip detection method）,建立了快速可视化检测锦鲤疱疹病毒的单交叉引物等温扩增检测方法（KHV-SCPA）。结果表明,最佳引物浓度组合为引物2a1s1.0μmol/L,2a（2a-Bio）和3a（3a-FIT）各0.5μmol/L,4s和5a各0.6μmol/L,M g2＋浓度为8.0 mmol/L,d NTPs浓度为1.2 mmol/L,反应温度63℃,时间60 min。本实验扩增产物经凝胶电泳呈现梯形条带,可特异性地检测出KHV,灵敏度较常规PCR方法提高约1 000倍。带有探针的反应产物采用核酸试纸条检测,在3～5 min内即可通过条带出现与否对反应产物进行可视化检测。KHV-SCPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于锦鲤疱疹病毒的现场快速检测中,为锦鲤疱疹病毒病的准确快速诊断和有效防控提供了技术支撑。; 李聪慧徐进刘文枝周勇曾令兵; 关键词：锦鲤疱疹病毒

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白在毕赤酵母中表达的初步研究被引量：3: 2012年; 根据GeneBank中草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)104株VP6蛋白的全基因序列(HM234682)设计一对特异引物,以提取的GCRV-104核酸为模板,采用RT-PCR技术扩增VP6蛋白编码基因,并将其克隆到含强启动子AOXⅠ的毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZB上。重组酵母质粒pPICZB-VP6经SacⅠ线性化,电击转化到毕赤酵母KM71菌株中,Zeocin抗性平板上筛选高拷贝转化子。阳性转化子在30℃,0.5%(V/V)的甲醇添加量的条件下,连续诱导3 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-Blotting检测,结果表明成功实现了GCRV-104 VP6蛋白在毕赤酵母中的胞内表达,重组VP6蛋白相对分子质量约46 000,与天然VP6蛋白相对分子质量接近,并且可与鼠抗草鱼GCRV-104 VP6蛋白的多克隆抗体特异性结合。; 苏岚曾令兵周勇张辉高正勇张金凤; 关键词：草鱼呼肠孤病毒

锦鲤鳍条组织细胞系的建立及其生物学特性被引量：14: 2012年; 采用组织块移植培养技术,对来源于锦鲤(Cryprinus carpiod)鳍条组织的细胞进行原代培养,建立了锦鲤鳍条组织细胞系,已稳定传代60多次,命名为Koi-Fin。锦鲤鳍条组织细胞为成纤维样细胞,最佳培养基为MEME,最适血清体积分数为10%,最适培养温度为25 oC,群体倍增时间为43.5 h。该细胞经液氮冷冻保藏12个月后采用台盼蓝染色,约(80.21±5.84)%的细胞具有细胞活性,复苏细胞生长旺盛。细胞染色体分析显示,第16代锦鲤鳍条组织细胞的染色体数目为正常二倍体2n=100,第40代细胞的染色体众数为52。病毒敏感性试验结果表明,Koi-Fin细胞系对锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV)敏感,可产生典型细胞病变效应,病毒滴度为107.86±0.51TCID50/mL。针对锦鲤疱疹病毒胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因设计特异性引物进行PCR检测,可扩增出病毒靶基因片段。; 肖艺曾令兵徐进周勇; 关键词：锦鲤细胞系生物学特性

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的截短表达及其免疫原性分析被引量：6: 2016年; 为了揭示鲤春病毒血症病毒（spring viremia of carp virus,SVCV）糖蛋白编码基因的主要免疫原性决定区域,本研究对SVCV的糖蛋白基因进行截短表达,并用纯化的重组蛋白作为免疫原制备了兔抗血清以分析其免疫原性。通过SOSUI以及DNAStar 6.0软件对SVCV糖蛋白基因的跨膜区、亲水性以及抗原表位进行分析后,采用RT-PCR对该基因主要抗原决定区域编码片段进行扩增,并构建重组表达质粒p GEX-Gtr,对其进行诱导表达后获得截短的SVCV糖蛋白的重组蛋白。将表达的重组蛋白进行纯化复性后,作为免疫原制备兔抗血清,采用ELISA法检测其效价,采用免疫印迹以及间接免疫荧光技术检测该重组蛋白的免疫原性。研究结果显示,截短表达的糖蛋白编码基因长1317 bp,编码439个氨基酸（29~467）,推测分子量为49.6 k D。利用该重组蛋白制备的兔抗血清,其与重组蛋白的反应效价为1∶64000,。免疫印迹及间接免疫荧光结果显示,该兔抗血清与SVCV-HN株能发生特异性反应,表明该重组蛋白与天然的病毒表面糖蛋白的免疫原性无差异。上述研究结果表明,截短表达的重组蛋白具有很好的免疫原性,可应用于免疫诊断技术研发与基因工程疫苗的研制。; 徐进周勇陈倩曾令兵; 关键词：鲤春病毒血症病毒免疫原性

鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性和超微形态发生被引量：11: 2016年; 为了查明鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)的理化与生物学特性以及病毒在细胞内的超微形态发生过程,利用新建立的对Cy HV-2敏感的异育银鲫脑组织细胞系(Gi CB),对Cy HV-2的理化及生物学特性进行了详细研究,比较了不同来源鱼类细胞系对Cy HV-2感染的敏感性,并对体外培养细胞中Cy HV-2病毒粒子及其超微形态发生过程进行了电镜观察。结果显示,Cy HV-2对热、酸、碱、有机溶剂和冻融敏感;常用鱼类细胞系EPC、RTG-2、Koi-Fin、CIK、CCK、PF-Fin对Cy HV-2的感染不敏感,特异性巢式PCR检测盲传至第7代Cy HV-2细胞培养物,结果均为阴性;Cy HV-2在Gi CB细胞中的增殖动态研究结果表明:病毒感染细胞经过12 h的隐晦期,24 h开始进入对数生长期,96 h病毒滴度达到最高值(107.52±0.26 TCID50/m L),然后进入平台期;透射电子显微镜观察结果显示,Cy HV-2感染细胞可分为吸附与侵入、复制与装配、成熟与释放3个主要过程,病毒进入对数生长期后,被感染细胞内可见形态典型的疱疹病毒颗粒。; 马杰周勇范玉顶刘文枝江南曾令兵; 关键词：理化特性生物学特性

饲料中灵芝提取物对异育银鲫生长、饲料利用、免疫应答及抗病的影响被引量：2: 2014年; 通过生长实验探求饲料中添加灵芝提取物饲料对异育银鲫(6.72±0.11)g生长、饲料利用及免疫应答的影响,以及停止灵芝提取物饲料后,使用效果的持续性。在实验进行的第21天(D21)、第46天(D46)、第65天(D65)进行取样,结果表明所有的灵芝提取物组的特定生长率在饲喂65d后与对照组无显著差异(P>0.05)。摄食率随着灵芝提取物在饲料中含量的增加而增加(P<0.05),饲料效率则有着相反的趋势(P<0.05)。在D46和D65时,随着灵芝提取物的含量增高,吞噬活力略有增高,但无显著差异(P>0.05)。在D21、D46和D65时,呼吸暴发活力随着灵芝提取物的含量增高而增高(P<0.05),在D21时,(0.6%-21d、0%-44d)处理组和(3%-21d、0%-44d)处理组其呼吸暴发活力高于对照组(P<0.05)。在D65时,(0.6%-21d、0%-44d)处理组和(3%-21d、0%-44d)处理组其呼吸暴发活力仍高于对照组(P>0.05),但差异不显著。D21、D46和D65时,替代途径补体溶血活力随着灵芝提取物的增高而降低(P<0.05)。所有处理组溶菌酶活力在D21时没有产生显著差异。在D46时,对照组溶菌酶活力比最高添加组低但高于低添加组(P<0.05),(3%-1d、0%-44d)处理组也仍高于对照组(P<0.05)。在D65时,所有添加组的溶菌酶活力均低于对照组(P<0.05)。在D65时,髓过氧化物酶活力随着灵芝提取物的添加剂量升高而升高(P<0.05),(0.6%-21d、0%-44d)处理组仍高于对照组(P<0.05)。灵芝提取物的能提高白细胞呼吸暴发活力,且在在高剂量摄入21d后(D46时),仍可以保持较高的活力,说明灵芝提取物对免疫应答有一定时间延续效应。随着灵芝提取物添加量的升高,异育银鲫在经爱德华氏菌攻毒后的存活率显著提高。最高存活率组为3%添加组,显著高于对照组(P<0.05)。实验周期为65d时,饲料中灵芝提取物推荐添加剂量为3%。; 陈宇航韩冬朱晓鸣杨云霞解绶启; 关键词：灵芝三萜异育银鲫

国家现代农业产业技术体系建设项目(CARS-46-11)

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