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一步法TaqMan~探针实时荧光定量RT-PCR快速检测PRRSV的建立及初步应用被引量：4: 2012年; 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了一步法检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法具有较高的特异性,与PCV,JEV,SFV,PRV,PPV无交叉反应;可以检测到10个拷贝数的模板RNA或1个TCID50的PRRSV,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<1%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对72份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出40份阳性,高于常规RT-PCR方法(28份阳性)。建立的荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于PRRSV的实验室快速诊断和流行病学调查。; 路斌袁秀芳徐丽华李军星郭勇王一成; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量RT-PCR 一步法

一步法TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR快速检测猪繁殖与呼吸综合征方法的建立及初步应用: 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了一步法检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法具有较高的特异性,与PCV﹑JEV﹑SFV﹑PRV﹑P...; 路斌袁秀芳徐丽华李军星王一成; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量RT-PCR

猪伪狂犬病毒浙江株感染性细菌人工染色体克隆的构建被引量：9: 2010年; 通过同源重组将携带细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)载体和GFP表达框的pHA2质粒序列插入到PRV病毒的UL23(TK)基因内,获得了重组病毒rPRV-HA2;将该重组病毒的环状基因组电转化到感受态细胞EscherichiacoliDH10B,筛选到病毒的感染性克隆PRV BAC(pPRV)。pPRV转染VeroE6细胞可以重新启动病毒的生产性感染,该拯救病毒的细胞病变和体外增殖特性与rPRV-HA2一致。病毒生长曲线表明TK基因的部分删除和BAC载体的插入不会影响病毒在体外的复制。PRV感染性BAC克隆的成功构建,将方便在大肠杆菌内对病毒基因组进行快速、准确的操作,为进一步开展PRV基因功能和病毒载体研究奠定基础。; 尹文玲尹龙勃叶伟成孙学强姚火春张淼涛王一成张存; 关键词：伪狂犬病毒细菌人工染色体感染性克隆重组病毒

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立被引量：5: 2013年; 基于猪圆环病毒2型(porcine circocirus type 2,PCV-2)的ORF2基因建立了一种便捷、灵敏而又特异的可视化环介导等温核酸扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法。该方法通过针对PCV-2 6个位点的4条特异性引物,在Bst DNA聚合酶的作用下对PCV-2靶序列进行等温核酸扩增。经过对LAMP反应体系和反应条件的优化,所建立方法在61℃反应1 h能够成功的检测出PCV-2基因组DNA,且操作简单,不需要PCR仪等复杂仪器,结果可经电泳检测及肉眼观察;敏感性和特异性试验表明,所建立的方法能特异地检测PCV-2并且其敏感度可以达到0.5 pg的DNA分子;所建立LAMP方法的阳性检出率与国标PCR的阳性检出率符合度为100%。该研究为PCV-2的现场快速检测提供更加简便、快捷的方法,可以满足基层检疫的需要。; 申世川王一成袁秀芳徐丽华李军星; 关键词：猪圆环病毒2型环介导等温扩增可视化

一步法CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR诊断方法的建立与初步应用被引量：3: 2015年; 根据猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,分别设计了1对特异性引物和1条Taq Man探针,建立了一步法检测CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法特异性高,与PCV2,PRV,PPV,PEDV,JEV,BVDV无交叉反应;可以检出20个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)低于4%,方法重复性好。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对50份疑似病例组织进行检测,结果荧光定量RT-PCR检出30份PRRSV阳性,13份CSFV阳性,均高于常规RT-PCR方法的检出数(24份PRRSV阳性,10份CSFV阳性)。本研究建立的双重实时荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高的特点,可用于PRRSV和CSFV的实验室快速诊断和流行病学调查。; 袁秀芳路斌徐丽华李军星王一成; 关键词：猪瘟病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒

猪主要DNA病毒多重二温式PCR检测方法的建立及初步应用被引量：2: 2012年; 通过对GenBank发布的猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的核苷酸序列进行比对分析,找出PPV的VP2基因,PRV的gH基因和PCV2的ORF2基因的相对保守区域。利用生物学软件在保守序列分别设计高溶解温度引物,将常规三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,通过对PCR反应条件的优化,确定最佳引物浓度、最佳聚合酶浓度、最佳退火温度以及最佳反应体积,建立了多重二温式PCR方法检测PPV、PRV和PCV2,其扩增的目的片断大小分别为PPV(142 bp)、PRV(300 bp)和PCV2(469 bp),从而节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对PPV、PRV和PCV2 3种猪主要DNA病毒进行检测。用30份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为95%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有高度特异、快速、敏感等特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。; 申世川王一成姜平袁秀芳徐丽华李军星; 关键词：PPV PRV PCV2

猪主要RNA病毒病多重二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用被引量：5: 2010年; 通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒病进行检测。用50份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为93%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。; 路斌王一成吴润袁秀芳徐丽华李军星王朝文; 关键词：CSFV PRRSV JEV

一步法TaqMan~探针实时荧光定量RT-PCR快速检测猪繁殖与呼吸综合征方法的建立及初步应用: 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了一步法检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法具有较高的特异性,与PCV﹑JEV﹑SFV﹑PRV﹑P...; 路斌袁秀芳徐丽华李军星王一成; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量RT-PCR; 文献传递

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浙江省重大科技专项基金(2008C12049)