中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(2010ZD04)
- 作品数：4 被引量：22H指数：3
- 相关作者：孔建强王伟安建梅史彦薇叶乐更多>>
- 相关机构：北京协和医学院药物研究所山西师范大学厦门大学更多>>
- 发文基金：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项国家自然科学基金海南省重点科技计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学轻工技术与工程更多>>
- 红色荧光蛋白在酿酒酵母中的表达特性研究
- 2012年
- 目的研究红色荧光蛋白编码基因Dsred在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达。方法根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠PCR方法快速克隆获得全长Dsred基因,将其与pMD-18T载体连接后进行测序鉴定。通过In-fusion方法将鉴定正确的pMD-Dsred重组载体与酿酒酵母表达载体pYeDP60进行连接,测序后利用LiAc方法将鉴定正确的pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌W303-1B中,PCR扩增筛选阳性克隆,获得的W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌经诱导培养后进行SDS-PAGE电泳分析和绿光激发荧光成像检测。将工程菌分别接种至YPD、YPG、SCG和SCD培养基,培养48、72、96、120和144h后分别测定吸光度(A600)值。取诱导表达后的工程菌(菌液组)进行离心(菌体组)、离心后加甘油(高渗组)处理,分别置于–70、–20、4、28和37℃条件培养,荧光显微镜观察其表达特性。结果连续重叠PCR扩增和测序鉴定结果表明,扩增获得的Dsred基因长为678bp,其序列与已发表的基因序列完全一致;Dsred基因已成功插入pYeDP60-Dsred重组表达载体,且受酵母诱导型启动子GAL10-CYC1调控表达。PCR扩增筛选和SDS-PAGE分析显示,pYeDP60-Dsred重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中,诱导表达产物相对分子质量与预期相符,且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光。4种培养基内工程菌的菌体生长情况无明显差别,重组Dsred红色荧光蛋白表达不会抑制酿酒酵母菌体生长。荧光显微镜观察显示,工程菌经不同处理后,高渗组红色荧光蛋白成熟时间最短,菌液组时间最长;红色荧光蛋白在37℃条件下培养时成熟最早,但降解速度较快。结论成功构建了pYeDP60-Dsred重组酿酒酵母表达载体,实现了Dsred基因在酿酒酵母菌体内的异源表达。红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响,且离心保留菌体和加入甘油等缺水高渗处理都有利于红色荧光蛋白的成熟。
- 史彦薇王志芳王伟安建梅孔建强
- 关键词：发光蛋白质类
- 温度和体重对克氏双锯鱼仔鱼代谢率的影响被引量：13
- 2012年
- 采用实验生态学的方法研究了不同温度和体重对克氏双锯鱼仔鱼呼吸和排泄的影响。结果表明,在23、26和29℃下,仔鱼个体日常呼吸率和排氨率与鱼体重呈幂函数(R=aWb)关系,即鱼体重越大其呼吸率和排氨率越大,b值随温度升高而增大,分别为0.8873,0.9033和0.9323(呼吸率),以及0.7625,0.8012和0.8278(排氨率)。温度和体重对克氏双锯鱼仔鱼个体呼吸率和排氨率的影响可用复合线性公式表示:RR=0.042(±0.007)W0.889(±0.026)×e0.122(±0.005)T,ER=0.002(±0.000)W0.797(±0.029)×e0.115(±0.007)T。比体重呼吸率和排氨率在相同温度条件下随个体增长而降低;在整个仔鱼期,比体重呼吸率和排氨率随温度升高而增加。克氏双锯鱼仔鱼呼吸和排泄Q10值在26—29℃较低,其可能是克氏双锯鱼仔鱼生长发育的最佳温度范围。克氏双锯鱼仔鱼在温度23—29℃时O/N范围为52—57,表明在温度23—29℃时克氏双锯鱼仔鱼代谢底物除了蛋白质外,脂肪和碳水化合物为能源也占了比较大的比例。
- 叶乐杨圣云刘敏朱小明王雨
- 关键词：仔鱼温度体重排氨率
- 甲型流感病毒NS1蛋白与人CPSF30结合拮抗剂酵母荧光筛选模型的构建与初步应用
- 甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1是个多功能蛋白,能和人CPSF30蛋白结合,抑制宿主细胞抗病毒蛋白pre-mRNA的加工,破坏宿主细胞抗病毒防线。本文采用双分子荧光互补技术针对NS1和CPSF30的相互作用,构建了一...
- 孔建强史彦薇王志芳王伟程克棣
- 关键词：甲型流感病毒实验药理
- 双分子荧光互补技术的应用与展望被引量：3
- 2013年
- 双分子荧光互补技术是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术。该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子,从而产生荧光。BiFC方法简单直观,具有可视性的特点,对温度敏感,荧光片段种类较多,被广泛地应用到不同的细胞中,既可以检测蛋白之间的相互作用,也可以定位蛋白质相互作用的位点。此外,BiFC还能在蛋白构型的确定以及RNA的检测方面发挥作用。经过若干年的发展,双色荧光互补技术已经发展成包括多色荧光互补技术,BiFC和FRET联用技术以及BiFC和YTH联用技术在内的多种技术,拓宽了BiFC的应用。
- 史彦薇孔建强安建梅
- 关键词：荧光蛋白蛋白质相互作用
- 甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1与人CPSF30结合拮抗剂筛选模型的建立及药物筛选被引量：6
- 2010年
- 利用酵母双杂交技术研究甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1和人切割与多聚腺苷酸化特异因子30kDa亚基(CPSF30)的相互作用,构建了一个酵母模型用于筛选NS1和CPSF30相互作用的拮抗剂,从而为筛选抗甲型H1N1流感病毒药物奠定基础。采用连续重叠PCR技术克隆得到H1N1流感病毒NS1基因。提取人HeLa细胞RNA,通过RT-PCR克隆得到人CPSF30基因。将NS1基因克隆到表达载体pGBKT7中获得诱饵载体pGBKNS1,将CPSF30基因克隆到载体pGADT7中获得捕获载体pGADCPSF;将pGBKNS1和pGADCPSF共转入酿酒酵母AH109,获得重组酿酒酵母AH109[pGADCPSF+pGBKNS1]。利用该模型筛选了30余种中成药,发现双黄连口服液等4种中成药能抑制NS1和CPSF30之间的相互作用。
- 孔建强沈君豪黄勇阮仁余项斌郑晓东程克棣王伟
- 关键词：H1N1流感病毒中药筛选
