国家自然科学基金(30960251)
- 作品数：12 被引量：23H指数：4
- 相关作者：石德顺刘庆友崔奎青邓彦飞王丹更多>>
- 相关机构：广西大学广西壮族自治区畜牧研究所西南大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家科技重大专项国家高技术研究发展计划更多>>
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- 不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响被引量：1
- 2012年
- 本研究探讨了不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响。水牛体外成熟卵进行ICSI介导转基因(ICSI-mediated gene transfer,ICSI-Tr)操作后,先用5μmol/L的离子霉素(ionomycin,Ion)激活处理5min,然后分成3组,再分别用10μg/mL放线菌酮(cycloheximide,CHX)培养5h(CHX5h组)、10μg/mLCHX培养3h后再用2mmol/L的二甲氨基嘌呤(6-DMAP)培养2h(CHX3h-DMAP2h组)或用培养液(CM)培养3h后再用2mmol/L6-DMAP培养2h(CM3h-DMAP2h组)。结果显示,CHX5h组的分裂率、早期胚胎基因表达率和囊胚发育率最高,且显著高于CM3h-DMAP2h组(66.7%比49.5%,p<0.05;66.7%比40.0%,p<0.01;22.2%比9.9%,p<0.05)。ICSI18h后检查原核形成率,发现CHX5h和CHX3h-DMAP2h处理组的完整精子头百分率显著低于CM3h-DMAP2h处理组(p<0.05),2原核(pronucleus,PN)百分率则显著提高(42.4%比23.8%,p<0.05;44.6%比23.8%,p<0.01)。以上结果表明,在水牛ICSI介导转基因时,Ion联合CHX较Ion联合6-DMAP激活重构胚效果好。
- 陈自洪韦珏孟凡丽陆凤花崔奎青石德顺
- 关键词：水牛
- 丙戊酸处理对猪手工克隆重构胚体外发育潜能的影响
- 2014年
- 为探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸(valproic acid,VPA)对猪手工克隆(HMC)胚胎发育潜能的影响,本研究比较了不同浓度(0、25、50、75和100nmol/L)VPA处理猪HMC重构胚对后期胚胎发育率、内细胞团数和组蛋白乙酰化程度的影响。结果表明,50、75nmol/L VPA处理组HMC重构胚的卵裂率和囊胚发育率均显著高于0、25和100nmol/L VPA处理组(P<0.05);与0、25、75和100nmol/L相比,50nmol/L VPA处理组能显著提高囊胚内细胞团细胞数(P<0.05),囊胚阶段VPA处理组的组蛋白H3K14乙酰化(AcH3K14)水平高于空白组和孤雌激活囊胚。因此,应用VPA处理可提高猪HMC重构胚胎分裂率、囊胚率及增加内细胞团细胞数,提高了猪HMC胚胎的体外发育潜能。
- 谢炳坤吕玲燕陆杏蓉崔奎青孙俊铭覃兆鲜石德顺刘庆友
- 关键词：丙戊酸发育潜能
- 水牛iPS细胞转录因子Sox2及协助蛋白HA2-TAT的原核表达被引量：1
- 2011年
- 为探讨干细胞转录因子与穿膜肽融合表达蛋白对水牛体细胞诱导重编程的可行性,本试验对水牛iPS细胞转录因子Sox2与细胞穿膜肽HIV TAT进行融合表达,以获得具有自主穿膜功能的Sox2蛋白,建立非转基因水牛iPS生产技术体系。首先人工合成了HA2-TAT序列,并将pET-32a(+)质粒改造为pET-HA2-TAT基础表达载体,再通过双酶切定向克隆将水牛Sox2基因插入pET-HA2-TAT得到原核表达载体pET-NLS-Sox2-TAT;重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,用SDS-PAGE电泳和Western blot检测融合蛋白表达,再用Ni 2+柱进行纯化融合蛋白。结果表明,成功表达了融合蛋白HA2-TAT(24 400)和NLS-Sox2-TAT(57 700);纯化蛋白NLS-Sox2-TAT在咪唑浓度为365.30mmol/L时,出现蛋白洗脱峰,经Western blot验证表达的融合蛋白具有免疫原性。
- 伏彭辉石德顺邓彦飞刘金凤刘庆友
- 关键词：水牛SOX2HIVTAT
- 丙戊酸处理对不同类型供体细胞猪手工克隆胚胎发育潜能的影响
- 2014年
- 为探讨丙戊酸(VPA)处理对不同供体细胞来源猪手工克隆(HMC)重构胚发育效果的影响,分别以猪卵巢颗粒细胞(GC)、猪胎儿成纤维细胞(PFF)和转基因猪胎儿成纤维细胞(Tr-PFF)为供体细胞,采用不同浓度(0、25、50、75、100、150nmol/L)VPA处理,观测比较不同试验组之间猪HMC重构胚发育的效果。结果显示,以GC为供体50nmol/L VPA处理组的猪HMC重构胚囊发育率达到48.92%,囊胚细胞总数为80.33个,极显著高于其他浓度组(P<0.01);以PFF为供体50、75nmol/L VPA处理组猪HMC重构胚囊胚率分别为52.82%和51.41%,极显著高于其他浓度组(P<0.01),其中50nmol/L处理组囊胚细胞总数为75.67,极显著高于其他浓度组(P<0.01);以Tr-PFF为供体100nmol/L VPA处理组的猪HMC重构胚囊胚率为42.74%,囊胚细胞总数为75.67,极显著高于其他浓度组(P<0.01)。结果表明,不同类型供体细胞对猪HMC重构胚的体外发育潜能有显著的影响,一定浓度的VPA处理可显著提高猪HMC重构胚体外发育囊胚率和细胞数,不同类型的供体细胞最佳VPA处理浓度亦有不同。
- 吕玲燕孙俊铭陆杏蓉张晓溪谢炳坤潘天彪刘庆友崔奎青石德顺
- 关键词：供体细胞VPA
- 不同逆转录载体系统应用于水牛胎儿成纤维细胞转基因的探索被引量：7
- 2013年
- 采用2种不同的逆转录病毒载体系统(pMX和pMSCV),构建携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组载体,探索能高效感染水牛胎儿成纤维细胞(BFFs)的病毒系统和感染方法.结果发现,2种逆转录病毒系统包装出的重组病毒滴度都能达到106,将pMX病毒系统生产的重组病毒经超速离心浓缩后,滴度可达到107;2种重组病毒都能感染BFFs,但pMX系统比pMSCV系统更能有效地感染BFFs;通过对病毒的感染方式进行比较,发现使用新鲜病毒连续感染BFFs 2次(每次间隔12 h),或者经过超速离心浓缩后的病毒感染BFFs 1次,可以显著提高感染效率.
- 邓彦飞刘真真李云芳刘庆友罗婵杨素芳石德顺
- 关键词：逆转录病毒载体转基因水牛胎儿成纤维细胞
- 沼泽型水牛NANOG基因5′调控序列克隆与功能分析被引量：6
- 2013年
- 为探讨沼泽型水牛NANOG基因的表达调控模式,本研究扩增克隆了广西本地沼泽型水牛NANOG基因的5′调控序列片段,设计了-1 213、-745、-425和-312bp 4个缺失体片段,分别构建成EGFP报告载体。应用显微注射报告载体生产转基因水牛和猪胚胎,并转染水牛胎儿成纤维细胞。结果发现,EGFP的表达仅限于水牛囊胚内细胞团。各缺失体在猪4.5d胚胎中均能启动下游EGFP的表达,转录活性两两之间差异均极显著,按活性从大到小依次为-745、-425、-1 213和-312bp。各缺失体报告载体转染水牛成纤维细胞48h后均可见少数细胞发光,其中-425bp活性极显著高于其他缺失体,-1 213与-745bp之间无显著差异,二者均极显著高于-312bp。以上结果说明,水牛NANOG基因翻译起始位点上游-1 213bp在水牛囊胚中可以调控NANOG在内细胞团中的特异性表达;-1 213～-745bp含有多能细胞特异性的抑制子元件;-745～-425bp含有多能性细胞特异性的增强子元件;-425～-312bp含有非多能细胞特异性的增强子元件。
- 崔奎青张会娜刘帅刘晓华杨素芳刘庆友石德顺
- 关键词：沼泽型水牛NANOG克隆
- 广西德保猪MC1R基因的克隆与分析被引量：2
- 2014年
- 近年来含有天然黑色素的动植物黑色食品得到青睐,为探讨广西地方品种德保猪全黑毛色形成的分子机制,本文克隆了广西德保猪MC1R基因并进行了系统生物信息学分析。根据NCBI已公布的猪MC1R基因序列(GI:347618788)设计特异性引物,以从德保猪血液中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆获得长1 519 bp的MC1R基因序列片段。多重序列比较结果显示克隆片段与已公布的猪、牛、人、狗、绵羊、小鼠和鸡的相似性依次分别为99%、87%、86%、85%、84%、81%和77%,表明MC1R基因在不同哺乳动物间具有较高的保守型。德保猪MC1R蛋白结构预测结果显示,其理论分子质量为34.65 ku,等电点为8.70,为弱碱性蛋白,N-末端不存在信号肽,定位于细胞质膜,具有1个低复杂度结构域和7个跨膜结构域,具有典型的细胞膜受体蛋白结构。多项研究报道表明MC1R基因是动物毛皮颜色重要的决定基因,德保猪MC1R基因克隆为揭示其全黑色形成的分子机制奠定了较好的实验基础。
- 杨厚德林宇纾廖玲玲刘庆友石德顺谢炳坤崔奎青
- 关键词：毛色
- 水牛抑制素α亚基基因RNAi载体构建与检测被引量：7
- 2011年
- 抑制素通过反馈抑制促卵泡素的合成与分泌影响动物的生殖功能,将动物的繁殖力控制在种属特有的水平。为探讨通过抑制素基因沉默提高水牛繁殖力的可行性,本文构建并筛选了水牛抑制素α亚基基因的RNAi载体。根据实验室克隆的水牛INH-α基因序列,设计合成了5对特异性单链siRNA序列,经退火形成双链,连入pSilenc-er4.1-CMV neo载体。重组质粒经酶切及测序正确后转染水牛卵泡颗粒细胞。48h后,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测不同组转染细胞中INH-α基因的相对表达水平,再选择沉默效率高的载体分别检测转染后24、48、72和96h抑制效率的变化。结果显示,经酶切和测序验证成功构建pSilencer4.1-145、pSilencer4.1-308、pSilencer4.1-769、pSilencer4.1-1013和pSilencer4.1-1053共5个重组RNAi表达载体,其中pSilencer4.1-308、pSi-lencer4.1-769、pSilencer4.1-1013和pSilencer4.1-1053具有抑制效果,抑制效率分别为58.8%、44.9%、67.4%和43.9%。选择pSilencer4.1-1013载体转染颗粒细胞24、48、72和96h后的抑制效率分别为27.1%、61.0%、57.0%、41.2%,转染48h后抑制效率最高。本研究成功构建了有效抑制的水牛INH-α基因表达的RNAi载体,为研制INH-α沉默的转基因水牛新品系奠定了基础。
- 谢琴蒋建荣王丹石德顺谢体三陈施蓓刘庆友
- 关键词：水牛RNAI
- 奶牛乳腺特异性表达人溶菌酶基因载体的构建与表达
- 2011年
- 为探讨应用转基因动物技术降低奶牛乳腺炎发病的可行性,参照人溶菌酶(human lysozyme,hLZ)基因序列(NM_000239.2)设计引物,采用RT-PCR方法从人胎盘组织中成功扩增克隆了406bp的hLZ基因成熟肽片段。应用娟姗牛酪蛋白乳腺特异表达调控元件,经过多步酶切、连接、转化、筛选、鉴定,构建成奶牛乳腺表达hLZ的载体pBCN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo(13.6kb)和pBCN-3.8-hLZ-1.1pA-EGFP-neo(12.2kb)。将构建的2个载体瞬时转染Bcap细胞,24h后可观察到EGFP的表达;通过实时定量PCR检测比较2个载体hLZ的表达丰度,结果,相对表达量分别为0.89±0.04和0.62±0.05。将线性化的pB-CN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo载体转染Bcap细胞,筛选后获得阳性细胞克隆,纯化阳性细胞总蛋白进行SDS-PAGE分析,与空白对照相比,检测到14ku的新蛋白条带。Western-blot分析中亦出现14ku的特异性条带。证实构建的载体能够正常表达hLZ基因,这为进一步研究获得自然抵抗乳腺炎的转基因奶牛奠定了工作基础。
- 刘庆友刘晟王丹李辉李湘萍罗婵陆凤花石德顺
- 关键词：奶牛乳腺特异性表达人溶菌酶基因转基因载体
- 水牛SOX2基因5′调控序列的克隆与功能分析
- 2013年
- 为探讨水牛SOX2基因的转录调控机制,本试验克隆获得其长2555bp的5′调控序列片段,结合生物信息分析设计了-2263、-1816、-1275、-660和-407bp 5个缺失体,并分别构建其EGFP表达报告载体,通过生产转基因早期胚胎和转染水牛胎儿成纤维细胞分析各缺失体片段的转录活性。结果发现,除-407bp以外的各缺失体在猪4.5d早期胚胎细胞中均能成功启动下游EGFP的表达,且随着片段缩短,其转录活性呈极显著递减趋势(P<0.01);而转染水牛成纤维细胞48h后,除p-407-EGFP以外的各缺失体报告载体转染组均观察到少数细胞发光,转录活性两两之间差异均极显著(P<0.01),转录活性从高到底排布分别为-2263、-660、-1275和-1816bp。p-407-EGFP载体在胚胎水平和细胞水平均未观察到荧光。以上结果表明,-660～-407bp是构成水牛SOX2基因表达不可缺失的部分,-2263～-1816bp中有非多能细胞特异性的增强子元件存在,而-1816～-1275bp和-1275～-660bp均含有多能性细胞特异性的增强子元件。
- 张会娜刘庆友刘帅路新梅邓彦飞罗婵石德顺崔奎青
- 关键词：水牛克隆
