浙江省自然科学基金(X204003)
- 作品数：6 被引量：7H指数：2
- 相关作者：张启瑜沈志坚谭映霞李传光孙运鹏更多>>
- 相关机构：温州医学院附属第一医院更多>>
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- 构建含有小鼠CD40-IgG2aFc—IRS—GFP融合基因腺病毒并体外检测被引量：2
- 2010年
- 目的构建载有小鼠CD40-IgG2aFc—IRS—GFP融合基因片段的腺病毒载体，并检测其转染293细胞后的融合蛋白表达及出毒情况。方法提取小鼠CD40、IgG2aFc基因片段构建PDC316-IgG2aFc—GFP质粒，测序成功后包装构建AdS—PDC316-CD40-IgG2aFc—GFP，转染293细胞。出毒后大量复制病毒并纯化，测定病毒滴度，体外感染细胞观察病毒复制及分泌目的蛋白情况并检测目的蛋白表达量。结果成功构建了质粒及病毒，体外感染显示该病毒能有效的感染细胞并表达蛋白（荧光显示），检测目的蛋白表达量随时间点及浓度增加而增加。当病毒浓度增加到一定程度时目的蛋白表达趋于无明显差异性。结论构建小鼠融合基因片段并成功转入细胞内，分泌表达目的蛋白是可行的，为进一步研究该病毒在大鼠体内感染及表达CD40Ig、大鼠肝移植模型免疫耐受及其机制的研究奠定了基础。
- 李传光方益锋谭映霞沈志坚张启瑜
- 关键词：CD40质粒构建
- 供肝冷保存门脉再灌注制备大鼠肝移植模型被引量：4
- 2009年
- 目的在Kamada"二袖套法"基础上采用供肝冷保存时经门静脉再灌注的方法建立稳定的大鼠原位肝移植动物模型,为以后进行肝移植免疫排斥、器官保存、缺血再灌注等进一步的实验研究提供安全、有效的模型制作方法。方法将30只接受供肝移植的SD大鼠随机分为5组(n=6):A为假手术组,开腹后不做任何处理即关腹;B组供肝修整后冷保存期不进行再灌注;C组供肝修整后以5ml生理盐水经门静脉灌注;D组供肝修整后以10ml生理盐水经门静脉灌注;E组供肝修整后以15ml生理盐水经门静脉灌注。然后以改良Kamada"二袖套法"完成大鼠原位肝移植模型,观察各组受体大鼠一般情况、生存情况、肝功能情况和组织病理学改变。结果B组大鼠术后苏醒时间明显长于A组和D组(P<0.05),其存活3d体质量下降程度均高于各组,和D组相比差异明显(P<0.05),B组存活一周体质量增加程度明显小于A、D、E组(P<0.05);B组中位生存时间明显短于A组、C组、D组和E组(P<0.05),D组和E组中位生存时间无明显差异(P>0.05);术后第1、4、7天实验组大鼠ALT显著高于对照组(P<0.05),而D组大鼠ALT值明显低于B组和C组(P<0.05);实验组术后ALB均显著低于对照组(P<0.05),但D组下降程度较低,其ALB仍明显高于B、C、E组(P<0.05),且于术后4d开始升高,E组术后ALB始终处于较低水平。结论通过改进技术改善肝功能,提高了生存率,尤其在冷保存时经门静脉再灌注,在供肝的质量上明显优于不进行灌注组,并应严格掌握灌注液体量,10ml灌注量明显优于其他液体量,能有效地驱除供肝内残留的血液和气泡。
- 孙运鹏廖毅杨文军周蒙滔施红旗张启瑜
- 关键词：肝移植再灌注动物模型
- 小鼠CD40Ig基因真核表达质粒的构建及鉴定
- 2008年
- 目的:构建含小鼠CD40Ig基因的真核表达载体,为诱导供体特异性移植物的免疫耐受的基因治疗作准备。方法:以小鼠脾脏总RNA为模板,以RT-PCR法克隆小鼠CD40胞外段cDNA及IgG2aFc段cDNA;另以pEGFP-N1质粒为模板获得绿色荧光蛋白(GFP)基因。将所得基因片段插入真核表达载体pDC516中得到重组质粒pDC516-CD40-IgG-GFP,测序鉴定正确后,用脂质体2000将其转染人胚肾上皮细胞(HEK293细胞),荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。结果:成功构建了小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP,并在HEK293细胞中实现表达。结论:小鼠CD40Ig基因真核表达质粒pDC516-CD40-IgG-GFP构建成功,为诱导供体特异性移植物免疫耐受的研究奠定了基础。
- 林丽谭映霞沈志坚俞康
- 关键词：质粒真核表达载体
- T细胞共刺激信号诱导器官移植免疫耐受的研究进展被引量：1
- 2007年
- 人们通过阻断T细胞共刺激信号在小动物实验成功导出抗原特异性的免疫耐受，共刺激信号是T细胞充分活化必需的信号，主要是由CD28和TNF：TNFR两大家族的成员介导的。若阻断此共刺激信号，T细胞不能有效活化和增殖，从而达到免疫耐受状态。
- 孙运鹏张启瑜沈志坚
- 关键词：器官移植共刺激信号免疫耐受
- 供肝转染含CD40Ig基因的腺病毒抑制大鼠肝移植急性排斥反应的研究
- 2010年
- 目的:通过腺病毒介导的CD40Ig基因治疗,阻断CD40/CD40L共刺激途径诱导免疫耐受,探讨CD40Ig对大鼠肝移植急性排斥反应的影响。方法:采用"二袖套管"法建立Lewis到BN大鼠肝移植急性排斥反应模型30只,A组10只为对照组;B组为病毒空壳组10只,术中肝脏冷保存前门静脉注射腺病毒空壳液1mL(7×1010vp/mL);C组10只为实验组,肝脏冷保存前门静脉注射含有CD40Ig基因病毒液1mL(7×1010vp/mL)。分别于术后4、7、10d每组各处死2只受体取血标本及肝组织,病理学检查肝组织及免疫组织化学检测CD40抗原的表达,ELISA法检测受体血清中的CD40Ig的表达,余大鼠观察生存情况。结果:C组移植大鼠平均存活时间延长至(53.25±13.37)d,较A组、B组明显延长(P<0.01)。C组肝脏急性免疫排斥明显减轻。A组、B组肝脏CD40抗原表达明显,C组未见CD40抗原明显表达。CD40Ig在受体内能成功表达,蛋白量于第7天最高,C组血中CD40Ig浓度明显高于A组、B组(P<0.01)。结论:重组CD40Ig基因的腺病毒能有效阻断T细胞共刺激途径,特异性抑制急性排斥反应,延长生存时间。
- 方益锋张启瑜李传光吕和平沈志坚
- 关键词：肝移植CD40重组腺病毒
- 含有小鼠CD40、IgG2aFc基因片段腺病毒的构建及检测被引量：2
- 2009年
- 目的:构建载有小鼠CD40-IgG2aFc-IRS-GFP融合基因片段的腺病毒载体,并检测其转染293细胞后的融合蛋白表达及出毒情况。方法:提取小鼠CD40、IgG2aFc基因片段构建PDC316-IgG2aFc-IRS-GFP质粒,测序成功后包装构建Ad5-PDC316-CD40-IgG2aFc-IRS-GFP,转染293细胞。出毒后大量复制病毒并纯化,测定病毒滴度,体外感染细胞观察病毒复制及分泌目的蛋白情况并检测目的蛋白表达量。结果:成功构建了质粒及病毒,体外感染显示该病毒能有效地感染细胞并表达蛋白(荧光显示),检测目的蛋白表达量随时间点及浓度增加而增加。当病毒浓度增加到一定程度时目的蛋白表达趋于无明显差异性。结论:构建小鼠融合基因片段并成功转入细胞内、分泌表达目的蛋白是可行的,为进一步研究该病毒在大鼠体内感染及表达CD40Ig、大鼠肝移植模型免疫耐受及其机制的研究奠定基础。
- 李传光谭映霞沈志坚张启瑜
- 关键词：CD40融合基因质粒构建重组腺病毒
