国家自然科学基金(31260343)
- 作品数：11 被引量：53H指数：5
- 相关作者：张金文王蒂张俊莲魏桂民张晶晶更多>>
- 相关机构：甘肃农业大学甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室甘肃省农垦农业研究院更多>>
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- 马铃薯sgt3基因启动子克隆及其功能鉴定被引量：2
- 2016年
- 【目的】克隆马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)的启动子序列并对其进行功能鉴定.【方法】采用染色体步移技术(genome walking)进行启动子的克隆,构建了该启动子驱动报告基因gfp::gus的植物双元表达载体p1304sgt3p,以pCAMBIA1304为阳性对照表达载体,采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达及稳定遗传转化,结合GUS组织化学染色对其进行功能鉴定.【结果】电泳图表明为1条长约2 500bp的特异扩增条带,瞬时表达和稳定遗传表达的烟草叶片的GUS组织化学染色结果均显示gus基因在转化烟草叶片中高效表达,并且低于阳性对照,非转化烟草叶片中无表达.【结论】成功克隆到sgt3基因起始密码子上游2392bp的启动子序列并且该启动子具有活性.
- 魏桂民李德文罗莉斯王少铭王军张金文王蒂
- 关键词：马铃薯启动子克隆
- 马铃薯Sgt1基因启动子的结构及功能分析被引量：10
- 2013年
- 糖苷生物碱(steroidal glycoalkaloids,SGAs)是一类存在于茄科和某些百合科植物的重要次生代谢物,与植物的抗逆性和产品品质有密切关系.茄啶半乳糖基转移酶(solanidine galactosyltransferases,SGT1)是SGAs合成代谢途径的末端关键酶之一,研究其编码基因的启动子序列对于SGAs生物合成代谢调控有重要的作用和意义.研究采用染色体步移技术(Genome walking),首次克隆到马铃薯Sgt1基因起始密码子上游2 183 bp的启动子序列,已注册到GenBank(注册号:KC759163).构建该启动子驱动融合报告基因gfp::gus的植物双元表达载体p1304Sgt1p,转化野生型烟草获得Sgt1p::gfp::gus转基因植株,通过GUS组织化学染色分析Sgt1p::gfp::gus转基因植株中Sgt1p启动子的活性.结果表明,gus基因在转基因烟草的根、茎和叶中均表达,在叶中Sgt1p启动子的活性低于CaMV35S启动子,而在根和茎中二者基本相同;光诱导结果显示,光照处理明显增强了Sgt1p::gfp::gus转基因烟草叶片中Sgt1p启动子的活性,表明庄薯3号马铃薯Sgt1p启动子是一种光诱导型启动子.
- 魏桂民张金文王蒂张俊莲陆艳梅高宜峰
- 关键词：马铃薯启动子报告基因
- 沉默马铃薯Sgt1-3基因减少块茎糖苷生物碱积累被引量：5
- 2017年
- 马铃薯茄啶-糖基转移酶(solanidine glycosyltransferase,Sgt)家族成员Sgt1、Sgt2和Sgt3参与糖苷生物碱(glycoalkaloids,GAs)合成。已有研究证明,抑制该家族任一成员表达可影响马铃薯块茎中糖苷生物碱合成;然而,对Sgt家族成员的单基因实施调控很难有效降低块茎中总糖苷生物碱的积累。为降低马铃薯块茎中总糖苷生物碱的含量,本研究拟采用RNAi技术,对糖苷生物碱合成代谢途径末端酶基因家族成员Sgt1-3在转录水平进行共调控。为实现这一目的,构建了块茎特异性启动子Patatin驱动的,以Sgt1、Sgt2和Sgt3基因为靶向的RNAi表达载体p CEI-PFR,采用农杆菌介导法转化马铃薯茎段,获得10株可沉默Sgt1、Sgt2和Sgt3基因表达的Patatin-RNAi融合基因的转基因植株。实时定量PCR(RT-q PCR)结果显示,Sgts基因的相对表达量分别降低了大约32%~60%(Sgt1)、29%~55%(Sgt2)和25%~66%(Sgt3),而草甘膦抗性基因——5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)的表达量则增加了约48%~135%。高效液相色谱法(HPLC)证明,尽管转基因株系的绿色组织中糖苷生物碱含量与野生型无显著差异,但块茎中糖苷生物碱分别比野生型降低了46%~59%(庄薯3号)和42%~62%(Favorita)。上述结果提示,复合沉默茄啶-糖基转移酶家族基因可降低马铃薯块茎中糖苷生物碱的积累。此外,该结果可能对研究马铃薯不同组织间糖苷生物碱的分布和积累,以及马铃薯种质资源的创新开发具有一定启示。
- 安然张晶晶郭海霞石文慧乔岩王志伟石菁张金文
- 关键词：马铃薯糖苷生物碱代谢调控基因沉默
- 马铃薯SGT3基因表达及其启动子功能分析被引量：7
- 2014年
- 鼠李糖转移酶(rhamnosyltransferase SGT3)是植物糖苷生物碱合成的关键酶,它主要调控α-茄碱和α-查茄碱从其β形式的转化。本文研究马铃薯栽培种SGT3基因的表达特点及其启动子的功能。实时定量PCR结果发现在红光照射24h后,SGT3的表达量是黑暗处理的26.8倍,说明红光显著诱导了SGT3的表达;为进一步分析该基因的光调控机理,本项研究克隆到SGT3上游长度为2449bp的启动子序列,通过分析发现该启动子的转录起始位点位于翻译起始位点上游-152bp,同时确定了该启动子核心序列及上游增强子、抑制子序列,受病原菌、损伤、干旱、ABA激素及一系列光调控的顺式元件。构建不同长度(349,572,979,1312和1870bp)的该启动子驱动报告基因GUS的植物表达载体并转化烟草。结果证明,不同长度的SGT3启动子都可以启动GUS表达,但没有CMV35S启动的GUS表达量高;其中在P572和P979的表达强度较高,这可能与该片段含有启动子的正调控元件(GATA BOX,5′UTRPY-RICH STRETCH)有关,GUS表达强度在P1312和P1870中明显减弱,预测到该区段存在抑制基因表达的负调控元件(WRKY710S);SGT3启动子的组织特异性实验表明GUS染色主要集中在烟草叶片的叶脉部分,茎中的表皮、韧皮部及木质部,但髓部几乎不表达,根中主要分布在根冠、分生区以及维管束组织中。上述结果为将来研究SGT3在糖苷生物碱合成过程中的调节功能提供了依据。
- 崔同霞白江平魏桂民赵旭王蒂张金文
- 关键词：基因表达启动子功能分析
- 马铃薯sgt2基因启动子的克隆及其活性分析被引量：4
- 2014年
- 糖苷生物碱(SGAs)是一类存在于茄科和百合科植物的重要次生代谢物,与植物的抗逆性和产品品质有密切关系.茄啶葡糖基转移酶(SGT2)是SGAs合成代谢途径的末端关键酶之一,研究其编码基因的启动子序列对于SGAs生物合成代谢调控有重要的作用和意义.本研究采用染色体步移技术,克隆到马铃薯茄啶葡糖基转移酶基因(sgt2)起始密码子上游2 098bp的启动子序列,已注册到GenBank(注册号:KC331038).构建该启动子驱动报告基因gfp∶∶gus的植物双元表达载体p1304sgt2p,采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达,通过GUS组织化学染色分析sgt2p启动子的活性.结果表明:gus基因在转化烟草叶片中高效表达,克隆的启动子具有活性.
- 魏桂民张金文王蒂张俊莲陆艳梅高宜峰
- 关键词：马铃薯糖苷生物碱启动子克隆
- 抗草甘膦与磷高效吸收基因双价表达载体的构建及对甘蓝型油菜的遗传转化被引量：3
- 2019年
- 【目的】甘蓝型油菜是产油效率较高的油料作物,在其生长过程中往往伴随着土壤环境中磷素匮乏及杂草胁迫,严重影响着最终产量和品质.因此,同时解决有效磷匮乏及草害问题已经成为目前油菜研究的重要方向.【方法】采用PCR法克隆得到了与草甘膦抗性(eCTP和EPSPS)和磷高效吸收(Pht1;2和phyA )的相关目的基因,随后构建了双价植物表达载体,通过农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,对转化植株进行PCR检测筛选,并通过qRT-PCR法对筛选的阳性植株内目的基因的表达进行定量分析.【结果】将PCR扩增得到的片段经琼脂糖凝胶电泳检测,结果符合预期.测序结果也与GenBank注册序列同源性高度一致,可用于后续试验.对转基因油菜进行草甘膦抗性筛选和PCR扩增检测,共获得5株转基因阳性植株.实时荧光定量结果发现转基因阳性植株内 phyA和EPSPS 基因的表达量均较对照植株有显著提高.【结论】本研究成功构建了抗草甘膦和磷高效吸收基因双价植物表达载体,获得的转基因阳性植株同时兼具草甘膦抗性及磷素高效吸收利用的特性,为培育甘蓝型油菜优良种质资源提供了理论依据.
- 王朋宝张晶晶石菁王威曹智张金文
- 关键词：甘蓝型油菜植酸酶基因特异性启动子QRT-PCR
- 马铃薯4种病毒多重PCR检测体系的建立被引量：6
- 2015年
- 我国马铃薯病毒主要有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV),常发生复合侵染。根据GenBank中4种马铃薯病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长设计引物,通过RT-PCR扩增得到4种病毒CP基因全长片段,测序结果显示序列同源性96%以上;针对4种病毒CP基因的保守序列分别设计引物,在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增,得到421、202、516、330bp的特异性条带,优化建立了能同步检测PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR检测体系。检测结果证明优化后的多重RT-PCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒。
- 庞博刘秀丽张金文王蒂张俊莲
- 关键词：分子检测多重RT-PCR马铃薯病毒
- 双重PCR检测马铃薯晚疫病和环腐病方法的建立被引量：5
- 2015年
- 通过克隆马铃薯环腐病菌和晚疫病菌转录间隔区(ITS)序列,并对测序结果进行同源性比较,选取差异位点分别设计了两对引物P.IN1/P.IN2和C.IN1/C.IN2,并检测了引物的特异性及方法的灵敏度。引物P.IN1/P.IN2可扩增出1条363bp马铃薯晚疫病菌的特异性条带,在DNA水平上其灵敏度达18fg/μL;引物C.IN1/C.IN2可扩增出1条218bp马铃薯环腐病菌的特异性条带,在细菌数上检测灵敏度为104 cfu/mL。混合这两对引物构建双重PCR反应体系,能从马铃薯环腐病菌和晚疫病菌的混合DNA及感染这两种菌的马铃薯植株中同时扩增到363bp和218bp的特异片段。实现了同时对马铃薯晚疫病菌和环腐病菌的快速可靠检测。
- 刘秀丽庞博张金文王蒂张俊莲
- 关键词：马铃薯双重PCR马铃薯晚疫病菌马铃薯环腐病菌
- 马铃薯地上部绿色组织中糖苷生物碱合成调控的研究被引量：5
- 2017年
- 为提高马铃薯品种(系)地上部分糖苷生物碱(SGAs)的含量,增强其抗逆性并改良块茎的品质。克隆了马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)cDNA和1,5–二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因启动子(rbcS P);对sgt3亚细胞定位预测显示,该蛋白不具有叶绿体转运肽、线粒体导肽和分泌信号肽序列,推测可能位于细胞质;将克隆的sgt3 cDNA片段及rbcS重组到pCEPSP载体上,构建了具有草甘膦抗性标记的绿色组织特异表达sgt3基因植物表达载体。通过农杆菌介导法对马铃薯品种‘陇薯3号’和‘夏波蒂’进行转化,共获得了12株抗草甘膦的阳性转基因植株。对转基因植株的目的基因表达水平和SGAs含量分析发现,地上部sgt3基因相对表达量较未转化植株提高1.3~3.0倍,SGAs含量增加20%~37%,而转基因植株的块茎中SGAs含量变化不显著。本研究的结果为进一步培育枝、叶中高SGAs而块茎中低SGAs的马铃薯抗性品种提供了理论依据。
- 郭海霞张晶晶安然乔岩石文慧石菁张金文
- 关键词：马铃薯糖苷生物碱
- 马铃薯糖苷生物碱的抑菌活性及其对菌体细胞膜透性的影响被引量：7
- 2017年
- 【目的】通过探究马铃薯糖苷生物碱对几种经济林病原真菌的抑菌活性及其可能的作用机理,为其在植物病害的无公害防治应用中提供理论依据.【方法】采用生长速率法,测定其对3种常见经济林植物病原真菌:腐皮镰刀菌(Fusarium solani),核桃盘二孢(Marssonina juglands),煤炱菌(Capnodiume leaophilum)的抑菌活性,并以腐皮镰刀菌为试材,应用电导仪测定其对菌体细胞膜通透性的影响.【结果】当马铃薯糖苷生物碱质量浓度为2g/mL时的抑菌效果最好;其中对腐皮镰刀菌的抑菌活性最强,其EC50为0.268 0g/mL,煤炱菌次之,对核桃盘二孢(Marssonina juglands)抑菌活性最弱,EC50为1.490 7g/mL;通过菌体细胞液电导率的测定,发现马铃薯糖苷生物碱作用下,腐皮镰刀菌菌体的相对渗透率增加了25.2%.【结论】马铃薯糖苷生物碱提取液对3种供试真菌均具有一定的抑菌活性,以对腐皮镰刀菌的抑制效果最佳,并引起其菌体细胞膜透性的增强.
- 多甜甜何静陈伟张金文冯生辉马鸿雁杜鹃党永旭
- 关键词：抑菌活性
