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国家教育部博士点基金(20030307012): 作品数：16 被引量：238H指数：9; 相关作者：姜平李玉峰蒋文明汤景元尹秀凤更多>>; 相关机构：南京农业大学长江大学高邮市畜牧兽医站更多>>; 发文基金：国家教育部博士点基金国家自然科学基金浙江省科技攻关计划更多>>; 相关领域：农业科学轻工技术与工程生物学医药卫生更多>>

不同引物RT-PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的比较研究被引量：23: 2006年; 用3对分别针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7、ORF5和ORF5的PCR引物N1/N2、AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2进行RT-PCR,检测PRRSV,从其敏感性、特异性和临床样品检出率等方面进行比较,在此基础上进一步建立一步法RT-PCR检测方法。结果显示:3对引物对PRRSV均有很高的特异性;应用N1/N2引物病毒最低检测量为7.9 TC ID50,而AdGP5.1/AdGP5.2引物和RFLP5.1/RFLP5.2引物PCR最低检测量为79 TC ID50;运用N1/N2、AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2引物分别进行RT-PCR扩增检测临床样品,PRRSV检出率分别为28/48、27/48和25/48,且用AdGP5.1/AdGP5.2和RFLP5.1/RFLP5.2引物检测的阳性样品,用N1/N2引物检测也都呈阳性。运用N1/N2引物,通过一步法RT-PCR成功地从PRRSV S1株中扩增出374 bp的目的基因片段。结果表明,用N1/N2引物扩增PRRSV目的基因,其敏感性和临床样品检出率更高,更适合临床样品PRRSV的检测。; 邓雨修李玉峰姜平蒋文明汤景元; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 RT-PCR 一步法RT-PCR

我国部分地区副猪嗜血杆菌病的流行病学调查被引量：25: 2007年; 采用细菌分离鉴定、结合PCR方法,对江苏、上海、安徽、广西、浙江、江西、山东、河南、湖北等省市2003年11月～2005年4月送检的159个患病猪场仔猪肺脏进行了副猪嗜血杆菌检测,结果阳性猪场为76个,阳性率48%,临床症状主要为呼吸困难和体温升高;病理变化主要有肺炎病变和淋巴结肿大或出血。通过数据统计分析,发现该病已在我国不同地区广泛流行,且多发于秋、冬季节。该研究为副猪嗜血杆菌的流行病学研究奠定了基础,也为该病的临床预防提供了理论依据。; 尹秀凤王艳姜平; 关键词：副猪嗜血杆菌流行病学细菌分离 PCR

M蛋白基因shRNA抑制PRRSV在Marc145细胞中复制的研究被引量：4: 2008年; 【目的】通过靶向PRRSV基因组中的M基因的siRNA来抑制PRRSV在Marc145细胞中的复制。【方法】构建4个能转录小发夹RNA(shRNA)的质粒,将其与靶蛋白表达质粒共转染HEK293A细胞,观察荧光或进行半定量PCR;或将其转染Marc145细胞,感染PRRSV后进行IFA、TCID50和实时PCR检测。【结果】shRNA表达质粒对M融合蛋白表达的抑制率约为50%,使M真核质粒表达蛋白的mRNA水平降低54%～64%,表达的shRNA在PRRSV感染后48h使病毒的TCID50和mRNA水平均降低到1/10～1/100倍,间接免疫荧光结果表明shRNA表达质粒转染孔的荧光细胞数显著减少。【结论】shRNA表达质粒特异性的抑制了靶蛋白M和PRRSV的复制,靶向PRRSV基因组M基因不同区域的siRNA可以作为控制该病毒传播的候选策略。; 黄娟姜平李玉峰蒋文明; 关键词：PRRSV RNA干扰

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白N端信号肽对其DNA免疫应答的影响被引量：6: 2005年; The GP5 gene which was spanned or truncated with hydrophobic signal peptide(tGP5) was amplified with RT-PCR and cloned into the downstream of promoter(CMV) of the pcDNA3.1,an eukaryotic expressing vector.The constructed plasmids were transfected into HEK-293A cells with anion lipid transfection reagent.Subsequently,the expression of the mRNA of interest gene was analyzed and confirmed by RT-PCR,and the expression of target protein was confirmed by indirect immunofluorescent assay(IFA).Each mouse was immunized with 100 μg of naked plasmid by intradermal injection.All groups were immunized four times with interval of 15 days.The neutralizing antibody against PRRSV were induced,but the antibody of group immunized with tGP5 gene produced slowly and the titer was lower than that in the group immunized with GP5 gene.It showed that the signal peptide of the GP5 protein of PRRSV is associated with the neutralizing antibody level of DNA immunization of pertinent GP5 gene.; 蒋文明姜平李玉峰; 关键词：PRRSV GP5 中和抗体信号肽

副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法的建立被引量：58: 2006年; 采用福尔马林灭活的副猪嗜血杆菌全菌体作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。经试验确定副猪嗜血杆菌全菌体的包被浓度为2·24×107CFU/孔、检测血清为1∶200稀释,同时确立了间接ELISA的最佳反应条件。该方法有很高的特异性和重复性,14个发病猪场100份血清检测结果Hps抗体阳性检出率为94%,明显高于细菌分离鉴定检测结果。; 王艳夏万田柏坤桃尹秀凤姜平; 关键词：副猪嗜血杆菌 ELISA 抗体

猪繁殖与呼吸综合征弱毒苗阴道免疫对母猪子宫IgA和IgG分泌细胞的影响被引量：8: 2005年; 用猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS) 弱毒苗分别通过生殖道黏膜免疫和肌肉注射免疫母猪 (各 4头 ), 另 4头经生殖道接种生理盐水作为对照, 运用免疫组化技术显示子宫局部IgA分泌细胞和IgG分泌细胞的分布。结果表明, 对照组子宫中IgA分泌细胞和IgG分泌细胞主要分布于黏膜固有层浅层, 子宫颈中的IgA分泌细胞数量多于子宫角, 而子宫角中IgG分泌细胞数量多于子宫颈。生殖道免疫后, 与对照组相比, 子宫角IgA分泌细胞数量极显著增多 (P<0 01), 子宫颈IgA分泌细胞数量无显著增加; 子宫角IgG分泌细胞数量有所增加, 但差异不显著, 子宫颈IgG分泌细胞数量无显著变化。肌肉注射后, 子宫中IgA和IgG抗体分泌细胞数量与对照组间无明显变化。表明用PRRS弱毒苗经生殖道黏膜免疫可增加子宫局部抗体分泌细胞数量, 而全身免疫对子宫抗体分泌细胞无显著影响。; 刘胜兵杨倩姜平; 关键词：生殖道子宫

串联表达PRRSV M与GP5蛋白重组腺病毒的构建及其免疫特性研究被引量：16: 2006年; 利用PCR扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒的M基因,按正确的读码框与GP5基因串联,成功构建穿梭载体pShuttle-CMV-M-GP5,经PCR、测序鉴定正确。PmeⅠ线性化后在BJ5183大肠杆菌内与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组,产生重组腺病毒DNA。重组腺病毒DNA经PacⅠ线性化后用脂质体转染HEK-293A细胞,在细胞内包装成完整的腺病毒,通过IFA可以检测到M与GP5串联的重组腺病毒构建成功,可以正确地表达目的蛋白。将构建好的重组腺病毒免疫小鼠,结果表明可以诱导产生较强的体液免疫应答(ELISA抗体和中和抗体)和细胞免疫应答(淋巴细胞增殖和CTL反应)。证明该重组腺病毒具有较好的免疫原性,为下一步猪体免疫试验奠定了基础。; 蒋文明姜平李玉峰汤景元王先炜杜以军; 关键词：PRRSV M GP5 重组腺病毒体液免疫

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与应用被引量：25: 2007年; 通过反应条件的优化、特异性和敏感性的测定,建立了一种快速、简便、准确的PCR方法,用于检测副猪嗜血杆菌(HPs)。PCR扩增片段大小为822bp,最小检测量为1080个HPs。与大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和链球菌无特异性反应。用该法检测人工感染猪的肺脏、心脏和肾脏抽提的DNA,结果为阳性;检测肝脏、脾脏、脑组织样品抽提的DNA,结果为阴性。用该法检测人工感染发病仔猪及自然感染仔猪肺组织,并结合细菌分离培养,证明以肺脏组织为病料,通过细菌分离培养,再用PCR法鉴定分离菌体,可有效地用于HPs的诊断。检测110份来自发病猪场的患病仔猪肺脏病料,其中有53份为阳性,表明HPs所致发的Glasser′s病已在我国部分地区发生和流行。; 尹秀凤王艳姜平李玉峰蒋文明; 关键词：副猪嗜血杆菌 PCR

副猪嗜血杆菌人工感染猪的病理学观察被引量：21: 2007年; 用副猪嗜血杆菌分离株感染断奶仔猪,发病仔猪临床表现为体温中度升高、精神不振、被毛粗乱、站立不稳、厌食、呼吸困难。尸体剖检,可见胸腹腔纤维素渗出严重,有大量的渗出液、肺出血及脑充血等;病理组织学表现为,肺脏、心脏、脾脏等脏器含有大量的中性粒细胞的纤维蛋白性多发性浆膜炎、脑膜炎及支气管肺炎。结果表明,此分离株为一高致病潜力的菌株。; 尹秀凤张书霞王艳姜平汤景元; 关键词：副猪嗜血杆菌病理学仔猪

DNA免疫法研制抗猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白中和性单克隆抗体被引量：7: 2006年; 目的：研制抗PRRSVM蛋白的单克隆抗体（McAb），以期获得中和性单克隆抗体。方法：将PRRSVM蛋白的基因克隆入真核表达载体pcDNA3．1，利用构建成的重组真核质粒免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗PRRSVM蛋白的单抗，建立间接ELISA方法筛选阳性克隆。利用试剂盒检测Ig亚类。通过免疫印迹（Western blot）、间接免疫荧光试验（IFA）鉴定McAb的特异性。间接ELISA和病毒中和试验检测杂交瘤细胞上清McAb效价和腹水McAb效价。结果：获得3株可分泌特异性抗PRRSVM蛋白抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1A7、4G3、51：3。1A7和4G3的Ig亚类为IgM。ELISA检测杂交瘤细胞培养上清效价为1：54～1：1024，腹水效价为1：3200～1：10240。同时用Western blot、IFA检测，结果均是阳性。4G3和1AT相对亲和力不同，证明其识别不同抗原位点。1AT和4G3具有病毒中和活性，中和效价达到1：96。结论：获得2株特异性抗PRRSVM蛋白的中和性单抗，为PRRSV诊断和免疫预防研究奠定了重要基础。; 马苏姜平李玉峰段舒怡; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体 M蛋白质粒中和抗体

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