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表达全人源抗人IgE单抗的细胞株构建及筛选被引量：2: 2015年; 目的:构建及筛选高效表达原创性全人源抗人Ig E单克隆抗体的重组工程细胞株。方法:将采用核糖体展示技术筛选到的原创性全人源抗人Ig E单链抗体(sc Fv)基因改构设计为Ig G1κ型全长抗体,构建重组真核表达质粒并电转染CHO-S细胞,Dot-blot法选取多株高表达克隆进行40ml摇瓶批次培养,再据细胞生长特征及抗体表达量选取高表达克隆进行40ml摇瓶及3L摇瓶流加培养研究,选取候选细胞株并对改构前后抗体的生物学活性进行比较研究。结果:成功构建了p MH3-H、p MH3-L、p CApuro-H、p CApuro-L四种重组真核表达质粒并成功共转染CHO-S细胞。完成了4次电转染8轮细胞克隆筛选,获得两株表达量较高的候选克隆Mab1#和Mab2#,在3L摇瓶流加培养中抗体表达量分别达到470mg/L及499mg/L。生物膜光干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)亲和力结果显示Mab1#及Mab2#两株单抗亲和力均达到nmol/L级(10-9),与现有唯一上市的抗人Ig E单抗药物奥马珠单抗(Omalizumab)的亲和力相当。选取Mab1#全长抗体与其改构前的母本单链抗体的表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)中和活性比较结果显示Mab1#抑制h Ig E与FcεRI结合的EC50为3nmol/L,EC90为9nmol/L,较改造前亲和力提高了4.3倍,中和活性(EC50)提高了23.7倍,中和活性(EC90)提高了41.3倍。结论:成功将表达原创性全人源抗人Ig E的单链抗体(约25k Da)改造为亲和力及中和活性均大幅提升的全长抗体(约150k Da),获得2个候选细胞株。; 张银川刘萌萌张雅婷桂芳张爱华闭兰潘勇兵; 关键词：单克隆抗体细胞株

全人源抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体毛细管等电聚焦鉴别方法的建立及验证: 2016年; 目的建立用于全人源抗人肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体鉴别的毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing,c IEF)方法,并进行验证。方法通过优化c IEF过程中各关键实验参数,如阴极稳定剂浓度、阳极稳定剂浓度、两性电解质浓度、3-10与8-10.5两性电解质比例、聚焦时间、聚焦电压,建立c IEF方法,并对方法的专属性、重复性、中间精密度进行验证。结果确定c IEF方法的实验参数为:阴极稳定剂浓度30 mmol/L,阳极稳定剂浓度3.2 mmol/L,3-10两性电解质在样品溶液中体积比为6.0%,聚焦电压为25 k V,聚焦时间为10 min。保护剂在样品出峰时间无紫外吸收峰,阳性对照阿达木单抗与样品出峰时间及峰形一致,阴性对照利妥昔单抗生物类似药、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗生物类似药、西妥昔单抗与样品出峰时间及峰形均不一致,且对样品无干扰;样品制备重复性主峰等电点的相对标准差(relative standard deviation,RSD)为0.114%,中间精密度RSD为0.837%。结论建立的c IEF方法 p H梯度和精密度良好,专属性较强,适用于制品的批放行鉴别试验。; 杨兰兰张银川吴小丽张雅婷桂芳吴师师闭兰潘勇兵; 关键词：肿瘤坏死因子-Α 单克隆抗体

全人源化抗人TNF-α单克隆抗体毛细管区带电泳鉴别方法的建立及验证: 2016年; 目的建立及验证用于全人源化抗人TNF-α(Tumor necrosis factor-α)单克隆抗体(简称抗人TNF-α单抗)鉴别的毛细管区带电泳(Capillary zone electrophoresis,CZE)方法。方法采用DB-1毛细管,以样品检测分离度、迁移时间、电流及峰形为判断标准,筛选CZE过程中的各种参数(缓冲液p H、ε-氨基乙酸浓度、乙酸钠浓度、羟丙基纤维素浓度、样品稀释剂、进样时间及运行电压等),建立CZE方法,并对方法的专属性、精密度、中间精密度进行验证。结果建立的CZE方法参数条件为:缓冲液p H为5.0,EACA浓度为300 mmol/L,乙酸钠浓度为20 mmol/L,HPMC质量分数为0.05%,用50 mmol/L Tris稀释样品,进样时间为15 s,运行电压为20 k V。样品制备重复性主峰迁移时间RSD为0.459%,中间精密度RSD为1.145%。结论 CZE方法分离度高、专属性强、重复性和精密度好、简单快速,可作为全人源化抗人TNF-α单抗的鉴别方法。; 杨兰兰桂芳张银川张雅婷潘勇兵闭兰吴小丽; 关键词：人肿瘤坏死因子Α 单克隆抗体毛细管区带电泳

抗人TNF-α单克隆抗体液质联用肽图分析方法的建立及验证被引量：4: 2017年; 目的:建立液相色谱-质谱联用肽图分析方法用于抗人肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)单抗的专属性鉴别。方法:TNF-α单抗样品经盐酸胍变性、还原,释放出的游离半胱氨酸残基进行烷化,还原剂中和过量的烷化剂。超滤置换酶切缓冲液后进行胰酶酶切并终止。色谱条件:采用Waters UPLC BEH 300 C_(18)(2.1 mm×150mm,1.7μm)色谱柱,以0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B)为流动相,梯度洗脱(5-120 min,2%B→45%B),流速为0.2 mL·min^(-1),检测波长为214 nm;质谱条件:采用电喷雾离子源及正离子模式,数据采集范围m/z为100~1990。结果:TNF-α单抗重链及轻链的6个互补决定区(CDR)对应肽段由质谱鉴定出,HC CDR2及HC CDR3在色谱峰图中共流出;利妥昔单抗用于评估本方法的专属性,结果显示本方法专属性强,且不受基质的干扰;选定m/z 1 344(M^(+5))的色谱峰为参考峰,根据CDR的相对保留时间考察该方法的变异程度,5次重复测定CDR相对保留时间的RSD在0.57%~1.19%之间;中间精密度考察测定的相对保留时间的RSD在0.00%~1.08%之间;胰酶酶切比例在20:1~30:1,酶切时间在17~23h范围内变化时,相对保留时间的均较小,符合方法耐用性的要求;样品消化后在8℃储存24h以及-20℃储存5d的稳定性良好。结论:基于CDR相关肽段鉴别的液质联用肽图分析方法可定性鉴定出TNF-α单抗,方法学验证结果显示该方法适用于抗人TNF-α单抗的专属性鉴别,可用于其质量控制及批检验放行。; 桂芳杨兰兰潘勇兵张雅婷张银川; 关键词：单克隆抗体液质联用

应用核糖体展示技术高效筛选人源抗IgE单链抗体被引量：4: 2012年; 本研究从哮喘患者外周血分离淋巴细胞、提取总mRNA,采用RT-PCR技术分别构建重链可变区VH(variable region of heavy chain)和轻链可变区VL(variable region of light chain)cDNA库,然后通过连接肽(Gly4Ser)3和特定引物将VH和VL cDNA基因组装成人源单链抗体(scFv)核糖体展示模板基因库。应用兔网织红细胞核糖体展示技术,单引物原位反转录技术,经3轮展示富集并回收针对人源IgE蛋白(免疫球蛋白E)的目的单链抗体基因;回收的抗体基因经双酶切后与pET22b(+)载体连接,转化至E.coli Rosseta(DE3)宿主细胞,应用菌落PCR结合Dot blotting技术快速鉴定阳性克隆,抗原ELISA法进一步鉴定阳性克隆。VH和VL基因库得到正确的构建,长度分别为400和710 bp,库容为1013。核糖体展示模板构建正确,长度为1 100 bp。该基因库经过3轮针对IgE蛋白的核糖体展示,目的基因得到了有效富集和回收。经过高效克隆、表达和鉴定,确定1株针对人IgE蛋白显示最强亲和力的阳性克隆菌pET-IgE-6。经测序和序列分析证实该单链抗体为人源抗体,序列未见国内外报道。结果表明,采用患者外周血构建人源抗体基因库,结合核糖体展示技术,可以成功获得高亲和力的人源单链抗体分子。该技术路线为快速获得具有药用价值的人源抗体提供了参考。; 张勇侠王保成余馨代云见何勇智丛聪夏永王明蓉; 关键词：免疫球蛋白E 人源抗体核糖体展示技术过敏性疾病

人PSMP重组蛋白在CHO细胞中表达、纯化及功能鉴定被引量：1: 2014年; 目的:构建新的具有趋化作用的人类细胞因子PSMP的真核表达载体,在仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)中表达并纯化,为PSMP的功能机制研究奠定基础。方法:从pcDNA3.1-PSMP-myc/His中切下PSMPmyc/His片段,插入pMH3表达载体。利用电穿孔法将该表达载体转染CHO细胞,G418抗性筛选稳定克隆株。以Dot blot及Western blot法检测上清液中PSMP蛋白的表达,利用有限稀释法对抗性筛选出的混合克隆单克隆化,悬浮无血清大批培养工程细胞,通过镍亲和层析法纯化蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度,Boyden小室体外趋化实验分析蛋白功能活性。结果:PSMP-myc/His基因插入pMH3载体后成功构建真核表达载体pMH3-PSMP,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达PSMP的基因工程细胞株。镍亲和层析纯化的重组蛋白PSMP纯度达95%以上且具有生物学活性。结论:成功构建了PSMP蛋白的真核表达载体,并获得其稳定表达的CHO细胞株,获得了较高纯度的、具有生物学活性的重组蛋白,为下一步PSMP功能和机制研究提供有用工具。; 马靖裴晓磊张扬王应; 关键词：CHO细胞

全人源抗人肿瘤坏死因子α单克隆抗体注射液对食蟹猴的长期毒性试验被引量：1: 2015年; 目的评价全人源抗人肿瘤坏死因子α单克隆抗体(抗-h TNF-αFHMA)注射液对食蟹猴的长期毒性。方法将40只食蟹猴随机分成5组,分别为阴性对照组、阿达木单抗10 mg·kg^(- 1)对照组和抗-h TNF-αFHMA 2,10和50 mg·kg^(- 1)组,经皮下注射每周给药1次,连续给药5次,停药后恢复期4周。实验期间进行临床观察、体质量、体温、心电图、血细胞计数、凝血功能、血液生化、尿液、眼科、免疫指标、脏器及组织病理观察,同时进行血药浓度检测,分析毒代动力学参数。结果实验期间各组食蟹猴的观察、体质量、体温、心电图参数、眼科检查、血细胞计数、凝血功能、血生化、尿液分析、淋巴细胞亚群、细胞因子、血清免疫球蛋白和血清补体等指标均未见与给药相关的具有毒理意义的改变;抗-h TNF-αFHMA和阿达木单抗均可引起食蟹猴体内产生抗药抗体,且具有中和活性。抗-h TNF-αFHMA在体内基本呈线性动力学特征。相同剂量下与阿达木单抗呈现相似的免疫原性和代谢动力学特征。结论抗-h TNF-αFHMA未观察到不良反应的剂量为50 mg·kg^(- 1),相当于临床拟用剂量(0.67 mg·kg^(- 1))的75倍,表明抗-h TNF-αFHMA临床应用安全性较好。; 张囡王炯张雅婷宋刚詹珊珊潘勇兵; 关键词：阿达木单抗毒性试验

应用小鼠肝坏死模型分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的体内中和活性: 2015年; 目的建立小鼠肝坏死模型,分析重组全人源抗肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)单克隆抗体的体内中和活性。方法确定D-半乳糖胺(D-galactosamine,D-Gal N)的致敏时间及TNF-α对C57BL/6小鼠的致死剂量;采用D-Gal N致敏小鼠,经腹腔注射TNF-α建立小鼠肝坏死模型,并测定3批供试品(抗TNF-α单抗)和3批阳性对照(阿达木单克隆抗体注射液)的体内中和活性,采用Probit回归拟合对活性测定结果进行分析。结果确定DGal N的致敏时间为10 min;TNF-α的致死剂量为100μg/kg体重;Probit回归拟合分析显示,拟合度较好,3批供试品对C57BL/6小鼠的半数有效剂量(ED50)分别为0.505、0.434和0.609 mg/kg,3批阳性对照对C57BL/6小鼠的ED50分别为0.455、0.571和0.484 mg/kg,供试品与阳性对照对C57BL/6小鼠的体内中和活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论联合应用D-Gal N和TNF-α可造成小鼠肝坏死,从而导致小鼠死亡,抗TNF-α单抗可阻断其效应。抗TNF-α单抗对TNF-α的抑制作用呈剂量-效应关系。; 张雅婷潘勇兵张银川张坤明任彬宋桂芝桂芳闭兰; 关键词：肿瘤坏死因子-Α 中和活性

抗VSTM1-v2细胞因子人源化单链抗体文库的构建及筛选: 2013年; 本文将鼠源VH-CDR3库(library of murine VH-CDR3)移植到特定的人源scFv(single-chain antibody fragment)VH3-VΚ1框架构建人源化scFv文库,快速筛选抗VSTM1-v2的人源化单链抗体。以抗VSTM1-v2鼠源cDNA为模板,扩增出鼠源VH-CDR3库,随后将鼠源VH-CDR3库移植到人源scFv(VH3-VΚ1)上并通过核糖体展示富集抗VSTM1-v2人源化scFv文库,该文库序列通过与原核基因表达调控等成分(N端添加T7启动子、SD序列和PelB序列、C端添加his标签序列和T7 terminal序列)拼接,构建表达型TA载体转化大肠杆菌BL21(DE3)进行可溶性表达。最终构建了一个库容达1012的人源化单链抗体文库,完成了1 000个克隆的初步鉴定,并筛选出EC50达21.35 nmol·L 1的抗VSTM1-v2人源化scFv。该研究结果,一方面获得了具有潜在应用价值的抗-VSTM1-v2先导抗体;另一方面,为快速获得人源化抗体提供了一个新技术途径。; 傅晓金张勇侠代云见王明蓉

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国家科技重大专项(2011ZX09506-005)

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