海南省自然科学基金(806119)
- 作品数：3 被引量：4H指数：2
- 相关作者：廖小平龙志刚陈涛文国强欧阳锋更多>>
- 相关机构：海南省人民医院中南大学中国热带农业科学院更多>>
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- 小泛素样修饰蛋白对α-突触核蛋白线粒体亚细胞定位及α-突触核蛋白经泛素系统降解的影响被引量：2
- 2010年
- 目的 探讨α-突触核蛋白（α-synuclein）的小泛素样修饰蛋白1（small ubiquitin-like modifier1,SUMO-1）化修饰对α-synuclein蛋白亚细胞线粒体定位及α-synuelein蛋白经泛素系统降解的影响.方法 构建野生型、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型α-synuclein真核表达质粒.将野生型、A53T突变型和K96R突变型α-synuclein真核表达质粒分别转染HEK293细胞;在转染后48 h通过应用线粒体染色剂和激光共聚焦技术,观察野生型、A53T突变型及缺失SUMO-1修饰的α-synuclein蛋白的亚细胞线粒体定位和蛋白聚集情况.在转染后48 h应用anti-ubiquitin抗体进行Western印迹分析,明确野生型、A53T突变型及缺失SUMO-1修饰的α-synuclein蛋白泛素化程度有无差别.结果 将构建所得EGFP-α-synuclein-WT、EGFP-α-synuclein-A53T、EGFP-α-synuclein-K96R真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实;激光共聚焦结果显示野生型、A53T突变型、K96R突变型α-synuclein蛋白均广泛分布于细胞质和细胞核中,以细胞质为主,野生型、A53T型细胞可见绿色荧光物质在胞质积聚,形成强荧光斑块,K96R型胞质内绿色荧光物质聚集少;野生型、A53T突变型、K96R突变型α-synuclein均与线粒体存在共定位,A53T突变型、K96R突变型α-synuclein在SUMO-1修饰或缺失的情况下对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响.Western印迹结果显示转染缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型α-synuclein真核表达质粒组的细胞泛素蛋白的含量与转染空质粒组相比无明显变化,转染野生型、A53T突变型α-synuclein真核表达质粒组HEK293细胞中泛素蛋白的含量减少.结论 α-synuclein基因过度表达及致病突变A53T对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位无明显影响;SUMO-1修饰对α-synuclein蛋白的线粒体亚细胞定位也无明显影响;SUMO-1对a-αsynuclein基因过度表达及A53T突变型α-synuclein细胞内泛素化蛋白数量产生影�
- 陈涛廖小平文国强龙志刚欧阳锋邓益东郭敏吴惠玲周鹏
- 关键词：Α-SYNUCLEIN基因亚细胞定位泛素化
- 小泛素样修饰蛋白-1对α-突触核蛋白基因突变或过表达诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响被引量：1
- 2011年
- 目的探讨α-突触核蛋白（ocsynuclein）的小泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-like modifier，SUMO）-1对α-synuelein基因过表达或突变诱导的细胞包涵体形成及细胞凋亡的影响。方法构建野生型（WT）、A53T突变型和缺失SUMO-1互作氨基酸的K96R突变型、K96R-A53T突变型ccsynuclein真核表达质粒。应用脂质体介导转染方式将构建好的质粒转入HEK293细胞；48h后Hoechst 33258染色，采用Axiovert200型倒置荧光显微镜观察对细胞的影响，应用四甲基偶氮唑盐检测细胞活力，AnnexinV-PE流式细胞仪检测细胞凋亡。结果将构建所得真核表达质粒经双酶切鉴定及DNA测序证实；将WT型、A53T型、K96R型、K96R-A53T型ccsynuclein真核表达质粒转染HEK293细胞，48h后伊红染色显示转染野生型。synuclein-pEGFP组及A53T突变型组某些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体（类Lewy小体）形成，分别占细胞总数的9．4％和11．7％，转染K96R及K96R-A53T融合表达载体组细胞内嗜酸性小体形成比率为10．2％和9．8％，两两相比差异无统计学意义（P〉O．05）。Hoechst染色结果显示，WT组、A53T组细胞核变大，出现着色不均，染色质聚集成斑点状，未见核浓缩或核碎裂。K96R组及K96R-A53T组胞核着色基本均匀。采用四甲基偶氮唑盐法结果显示转染空质粒组细胞活力为96．2％，转染WT组、A53T组细胞活力下降至53．4％及56．1％，转染K96R组及K96R-A53T组细胞活力为72．3％和69．8％；转染48h后，WT组、A53T组细胞凋亡率分别为32．2％和34．1％，转染K96R组及K96R-A53T突变组细胞凋亡率下降为19．4％和20．3％，两两相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论SUMO-1对α-synuclein基因过度表达及α-synuclein基因致病突变A53T诱导的细胞包涵体的形成无明显影响；SUMO-1可加强α-synuclein基因过度表达及。synuelein基因致病突变A53T诱导的细胞毒性及细胞凋亡，提示SU
- 陈涛廖小平文国强龙志刚欧阳锋邓益东郭敏
- 关键词：细胞凋亡帕金森病
- RNA干扰技术阻断α-synuclein基因过表达秀导的α-synuclein蛋白病理性积聚的研究被引量：3
- 2008年
- 目的构建并筛选针对帕金森病致病基因α-synuclein特异、高效的RNA干扰载体，观察应用RNA干扰技术阻断α-synuclein过表达导致α-synuclein蛋白病理性积聚的作用。方法采用携带Hl启动子的PBSHHl质粒，设计并构建针对α-synuclein基因4个可有效表达发夹状RNA的特异性α-synuclein基因干扰载体pSVNi-1、pYNi－2,pSYNi－3、pSVNi－4，通过限制性内切酶酶切、DNA测序证实后，转染HEK293细胞，应用Western印迹、逆转录－PCR观察干扰载体的有效性，筛选特异、高效的RNA干扰载体。采用脂质2000将筛选的最佳α-synuclein-pBSHI RNA干扰载体及野生型α-synuclein-pEGFP真核细胞表达载体共转染HEK293细胞，并设立对照组，48h后采用Axiovert200型倒置荧光显微镜、荧光免疫细胞化学观察其在细胞内的表达，HE染色观察细胞质内嗜酸性小体的形成。结果Western印迹、逆转录－PCR结果显示，pS,CNi－1载体具有高效的RNA干扰抑制作用，效率达69．6％；将α-synuclein-pBSHHl RNA干扰载体pSYNi-1及野生型α-synuclein-pEGFP真核细胞表达载体转染HEK293细胞，48h后荧光显微镜下观察细胞在波长488nm蓝色激发光下发出明亮的绿色荧光，其中对照组某些细胞质内出现绿色荧光物质积聚，而转染psyni-1干扰组细胞质内绿色荧光物质分布均匀；免疫荧光细胞化学检测结果显示，转染48h后对照组可见α-synuclein免疫阳性产物在胞浆内聚集，转入RNA干扰载体pYNi-1后胞浆内α-synuclein免疫阳性产物分布均匀；HE结果显示，转染48h后，对照组某些细胞质内出现圆形的嗜酸性小体（类Lewy小体）形成；转入RNA干扰载体pSVNi-1后胞浆内未见类Lewy小体形成。结论RNA干扰技术通过抑制α-synuclein基因的表达，成功阻断了野生型α-synuclein过表达所诱导的α-synuclein蛋白病理性积聚，为最终应用RNA干扰技术临床治疗帕金森病提供了某些依据。
- 陈涛唐北沙廖小平文国强严新翔郭纪锋张玉虎曹立李静欧阳锋龙志刚
- 关键词：RNA干扰Α-SYNUCLEIN基因
